【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，尤其涉及一种牛耳朵幼苗的繁育方法和应用。
技术介绍
1、牛耳朵(chirita eburnea)，别名牛耳岩白菜、石三七、石虎耳、牛耳岩、白菜，隶属于苦苣苔科(gesneriaceae)唇柱苣苔属(chirita)，分布于广东北部、广西北部、贵州、湖南东南部、四川南部及东部、湖北西部，常长在海拔100至1500米的石灰山林中石上或沟边林下，多年生草本，具粗根状茎，叶均基生肉质，叶片卵形或狭卵形，长3.5-17厘米，宽2-9.5厘米，边缘全缘，两面均被贴伏的短柔毛，有时上面毛稀疏，花期4-7月，因其叶子形状酷似牛的耳朵而得名。据《广西植物名录》记载，中药材牛耳朵全草入药或用根茎入药，是一种具有清肺、止血、解毒和补虚止血功效的中药材，通常用来治疗治肺结核、咳喘、吐血、红崩白带等疾病。用新鲜牛耳朵根茎去掉外皮切片，与蜂蜜拌匀食用，对气虚劳伤、肺浊咳嗽有很好的调理效果，亦可用牛耳朵根茎或全草煎汤内服，可治疗、咳喘、吐血、红崩白带等疾病。中药材牛耳朵不但是一味良药，而且因其花朵鲜艳独特、花期较长、四季常绿、形态优美，具有极高的观赏价值和育种价值而深受人们喜爱。
2、目前，由于牛耳朵本身自然繁殖能力低弱，人们乱采滥挖，同时石灰岩地区生态环境持续恶化等因素影响，牛耳朵野生种群个体数量逐年减少，亟待开展保护工作。
3、文献(牛耳朵的离体培养和快速繁殖,植物生理学通讯,2006,42(5):1)公开了利用幼叶及花梗作为外植体进行组织培养，获得试管苗的方法。其中，花梗愈伤组织诱导率达80％，幼嫩叶片愈
技术实现思路
1、本专利技术提供一种牛耳朵幼苗的繁育方法，采用牛耳朵叶片为外植体，通过诱导叶片双面丛生芽的萌发优化了繁育技术体系，获得了大量优质幼苗。
2、本专利技术还提供了一种牛耳朵幼苗的繁育方法在牛耳朵幼苗繁育中的应用。开展牛耳朵繁育及应用研究，不但能稳定牛耳朵种群数量实现该物种的资源保护，为其可持续开发利用奠定基础，更能提升生态系统的稳定性和复原力，在保护生物多样性和长江大保护等方面具有重大的生态意义和现实意义。
3、本专利技术第一方面提供了一种牛耳朵幼苗的繁育方法，包括如下步骤：
4、1)外植体预处理：选取牛耳朵叶片为外植体，清洗消毒后用无菌滤纸吸干水分；
5、2)诱导培养：将预处理后的外植体切成(1.0-2.0)cm×(1.0-2.0)cm的块状物，并接种至第一培养基中进行诱导培养，得到具有双面丛生芽的诱导培养物；
6、其中，第一培养基包括kt、tdz、naa、ε-聚赖氨酸、ga3中的至少三种；培养方法包括：第1-7天采用暗培养，第8天后采用光照培养，培养温度为23℃±2℃，培养时间为20-25天；光照培养具体包括：第8-15天采用led红白复合光照培养，第15天后采用荧光灯培养，光照培养期间的光照强度为2500-3000lx，光照时间为每天10-13小时；
7、3)增殖培养：将诱导培养物从第一培养基中取出，沿垂直于叶面的方向对诱导培养物切“十”字，得到4个第一切割部分；再沿平行于叶面的方向，对第一切割部分进行横切，得到2个含有单面丛生芽的第二切割部分；将含有单面丛生芽的第二切割部分接种至第一培养基中进行增殖培养，得到增殖培养物；
8、4)壮苗与生根培养：将增殖培养物从第一培养基中取出并接种至第二培养基中进行壮苗和生根培养，培养结束后得到牛耳朵幼苗。
9、本专利技术采用牛耳朵叶片为外植体，一年四季随时都可取材且不会影响物种数量和繁衍，通过叶片双面萌发丛生芽优化了繁育技术体系，提供了一种诱导叶片双面萌发丛生芽从而繁育药用植物牛耳朵的方法，获得了大量优质幼苗。
10、在一种具体实施方式中，本专利技术提供的牛耳朵幼苗的繁育方法具体包括如下步骤：
11、步骤1、外植体预处理：选取牛耳朵叶片为外植体，清洗消毒后用无菌滤纸吸干水分。
12、根据本专利技术的实施方式，选取牛耳朵叶片具体包括如下步骤：
13、以野生或大棚培养的牛耳朵植株，遵循幼嫩为主、适当剪去的原则，对牛耳朵上1-3月龄的叶片从基部进行截取，并沿基本垂直于叶片主脉的方向，对截取得到的叶片进行切割，得到靠近基部的下部分叶片、远离基部的上部分叶片、位于上部分叶片和下部分叶片之间的中部叶片。
14、由于在自然环境中采集的外植体表面会携带大量的微生物，所以需要对外植体进行清洗消毒，以降低培养基污染导致培养失败的概率。然而，在外植体清洗消毒过程中，上部分叶片和下部分叶片经过药剂浸泡后，其植物组织相较于中部叶片更容易受损。因此本专利技术以中部叶片作为外植体，可以降低叶片受损对实验产生的不利影响。
15、进一步地，对从牛耳朵植株上切割得到的中部叶片进行清洗消毒，具体包括如下步骤：
16、步骤1-1、将外植体使用纱布包裹后浸泡在洗衣粉水中，浸泡3-6分钟后取出外植体，并置于流动水下冲洗30-50分钟。其中，纱布包裹可以预防外植体在液体中漂浮导致清洗消毒效果的降低；洗衣粉水为表面活性剂，可以提高清洗效果；流动水冲洗则能够将污染以及残留的洗衣粉水洗去。
17、步骤1-2、将冲洗干净的外植体转移至超净工作台，并浸泡在浓度为75％的医用酒精中20-40秒，浸泡结束后使用无菌水冲洗1-2次。其中，浓度为75％的医用酒精是表面消毒剂，具有较强的穿透力促使菌体蛋白质变性，还具有较强的湿润作用，可以排除材料上的空气有利于其他消毒剂的渗入；无菌水冲洗则能够减轻消毒剂对植物细胞的杀伤副作用。
18、步骤1-3、将无菌水冲洗后的外植体置于含有升汞和吐温80的清洗液中浸泡5-10分钟，浸泡结束后使用无菌水冲洗3-5次。升汞(氯化汞)为消毒剂，升汞的hg2+可以与带负电荷的菌体蛋白质结合，使菌体蛋白质变性；吐温80为表面活性剂，加入消毒剂中，能够帮助消毒剂更容易浸入到外植体表面。其中，升汞与吐温80的具体配比可以根据本领域常规技术手段进行调整。
19、清洗结束后，使用无菌滤纸吸干外植体上多余的水分。此外，清洗和消毒会造成外植体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种牛耳朵幼苗的繁育方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述增殖培养物进行切割，得到具有丛生芽的第三切割部分，并将第三切割部分接种至第一培养基中进行增殖培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选取牛耳朵叶片包括如下步骤：对牛耳朵上1-3月龄的叶片从基部进行截取，并对截取得到的叶片进行切割，得到靠近基部的下部分叶片、远离基部的上部分叶片、位于上部分叶片和下部分叶片之间的中部叶片；以所述中部叶片作为外植体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述清洗消毒包括如下步骤：
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤2中，将外植体切成2.0cm×2.0cm的块状物，并平铺在第一培养基中，叶片放置朝向为背面朝上。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，基于每升的第一培养基，所述KT的质量为0.05-0.1mg、TDZ的质量为0.1-0.5mg、NAA的质量为0.5-1.0mg、所述ε-聚赖氨酸的质量为0.01-0.0
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述第二培养基包括IBA、Ac中的一种或两种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二培养基包括IBA和Ac，所述IBA的体积分数为0.3-0.7mL/L，Ac的质量分数为0.05-0.2％。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤2-3中，诱导率不低于70％，增殖率不低于80％。
10.根据权利要求1-9任一项所述方法在牛耳朵幼苗繁育中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种牛耳朵幼苗的繁育方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述增殖培养物进行切割，得到具有丛生芽的第三切割部分，并将第三切割部分接种至第一培养基中进行增殖培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选取牛耳朵叶片包括如下步骤：对牛耳朵上1-3月龄的叶片从基部进行截取，并对截取得到的叶片进行切割，得到靠近基部的下部分叶片、远离基部的上部分叶片、位于上部分叶片和下部分叶片之间的中部叶片；以所述中部叶片作为外植体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述清洗消毒包括如下步骤：
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤2中，将外植体切成2.0cm×2.0cm的块状物，并平铺在第一培养基中，叶片放置朝向为背面朝上...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海波，敦必成，吴笛，项伟波，
申请(专利权)人：中国长江三峡集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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