一种基于尿嘧啶引物PCR的基因组步移方法技术

本发明专利技术公开了一种基于尿嘧啶引物PCR的基因组步移方法，通过在随机引物（arbitrary walking primer，AWP）3’端的倒数第二个位置引入了尿嘧啶碱基，并在二级UP‑PCR之前，使AWP序列在UNG的作用下被破坏，使得在二级UP‑PCR的热循环中，避免不需要的扩增子被扩增，仅两轮UP‑PCR就足以完成基因组步移任务，并获得足够的扩增特异性，相较传统的热不对称交错PCR、腕表PCR、桥接PCR等基因组步移方法更为简单易行，且具有同等的成功率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及pcr步移，具体涉及一种基于尿嘧啶引物pcr的基因组步移方法。

技术介绍

1、基因组步移又称染色体行走，是一种应用广泛的分子生物学研究技术。现代基因组步移技术主要是以pcr为基础的，利用pcr扩增已知基因组dna附近的未知基因组区域，从而获得更多的序列信息。这些技术具有广泛的应用场景，包括研究基因表达和调控机制、确定插入位点、填补基因组测序空白等。

2、根据是否需要预处理基因组模板，这些基于pcr的基因组步移方法可分为i型和ii型。i型基因组步移技术涉及pcr前的基因组dna预处理，主要包括dna消化和随后的结扎。第一类技术包括alu-pcr、vectorette pcr、casstte pcr等。ii型技术(即随机引物pcr)完全基于pcr，在pcr之前没有任何预处理。ii型技术通过对任意游动引物在未知侧翼区域的随机退火来实现行走。ii型包括叉式pcr、热不对称交错pcr、和腕表pcr等。ii型因其简单、有效，成为基因组步移的主流方法。

3、为了实现所谓的行走，随机引物pcr必须在初级扩增中执行至少一个非严格循环，以本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于尿嘧啶引物PCR的基因组步移引物，其特征在于，所述基因组步移反应的引物包括三个嵌套的SSP和三条AWP，分别为gadA-oSSP、gadA-mSSP、gadA-iSSP、gadR-oSSP、gadR-mSSP、gadR-iSSP、hyg-oSSP、hyg-mSSP、hyg-iSSP和AWP1、AWP2、AWP3；引物AWP和引物oSSP用于一级UP-PCR扩增反应，产物添加UNG处理后用于二级UP-PCR扩增反应；所述二级UP-PCR扩增反应引物包括引物AWP和引物mSSP；引物AWP和引物iSSP用于三级UP-PCR扩增反应，用于选择性富集目标产物。p>

2.根据权...

【技术特征摘要】

1.一种基于尿嘧啶引物pcr的基因组步移引物，其特征在于，所述基因组步移反应的引物包括三个嵌套的ssp和三条awp，分别为gada-ossp、gada-mssp、gada-issp、gadr-ossp、gadr-mssp、gadr-issp、hyg-ossp、hyg-mssp、hyg-issp和awp1、awp2、awp3；引物awp和引物ossp用于一级up-pcr扩增反应，产物添加ung处理后用于二级up-pcr扩增反应；所述二级up-pcr扩增反应引物包括引物awp和引物mssp；引物awp和引物issp用于三级up-pcr扩增反应，用于选择性富集目标产物。

2.根据权利要求1所述的一种基于尿嘧啶引物pcr的基因组步移引物，其特征在于，所述三条awp在3’端倒数第二个位置有一个尿嘧啶碱基。

3.根据权利要求1所述的一种基于尿嘧啶引物pcr的基因组步移引物，其特征在于，所有引物的熔融温度为60～65℃，无明显的发夹和自二聚体结构，所有引物对均不存在明显的引物间二聚体。

4.根据权利要求1所述的一种基于尿嘧啶引物pcr的基因组步移引物，其特征在于，所述一级up-pcr扩增反应的低温退火温度为25℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海星，陈红，王蓉蓉，田冰坤，李谋，汤庆春，潘振康，潘豪，郭新月，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：