本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种利用单核苷酸多态性预测绵羊眼肌性状的方法。用ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ?２和ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ３所述的引物对绵羊的总ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，然后再对ＰＣＲ扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ?１的５’端第７３位碱基为Ｇ还是Ａ，具有Ｇ等位基因的个体有较大的眼肌面积和眼肌宽度。该多态位点的检出，不仅为分子育种提供了新的素材，同时为绵羊眼肌性状的标记辅助选择提供科学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域中一种利用单核苷酸多态性预测绵羊眼肌性状的方法。
技术介绍
根据一个物种已知的基因序列设计简并引物是获得另一个物种未知基因的一种 发法。获得基因后可以利用生物信息学手段对新基因进行功能预测，并通过半定量RT-PCR 和荧光定量PCR对该基因进行组织表达分析，通过多态性分析进行验证。钙蛋白酶抑制 蛋白(Calpastatin，CAST)基因在小鼠、人、兔和牛等物种存在不同的转录本，而且不同 的转录本在不同组织中的表达存在差异(Emori et al. ,1987, Proc Natl Acad Sci USA 84(11) 3590-3594 ；Killefer andKoohmaraie, 1994, J Anim Sci 72(3) 606-614 ；Takano et al. ,2000, JBiochem 128(1) :83_92)。Zhu等人发现CAST在睾丸组织中存在一新的亚 型，克隆了新基因，并推测可能与精子的发生与关(Zhu, H. et al.，2002，Acta Pharmacol Sin 23(5) :450_454)。单核苷酸多态性标记(singlenucleotide polymorphism, SNP)是 1996 年被美 国MIT的Ε. Lander提出的，被称为“第二代DNA遗传标记〃。其基本原理是对于一个经 PCR扩增后具有固定长度的DNA片断，其分子构象是由碱基序列所决定的，因此单个碱基的 改变能够引起DNA分子单链或等位基因间形成的错配异源双链在变性条件下存在微小的 构象差别，这些不同的构象体在电泳或高效液相检测中因移动性的差异而得以区分。SNP的 检测可以通过PCR-SSCP、PCR-RFLP、测序及SNP芯片等多种技术实现。目前知道牛的CAST基因存在四种转录本，但在羊上CAST基因的研究较少，而且 GenBank上的序列不能清楚知道它属于CAST基因的那种转录本。有关羊CAST基因SNP的 检测及功能验证研究还是一个空白，对于羊的标记辅助选择及育种带来很大的障碍。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种绵羊单核苷酸多态性标记，自SEQID No 1所示序列 的5’端起第73位碱基为G或者A。本专利技术还提供上述的绵羊单核苷酸多态性标记在绵羊眼肌性状预测中的应用。本专利技术的目的是提供利用单核苷酸多态性检测绵羊眼肌性状的引物，其序列如 SEQ ID No 2 和 SEQ ID No 3 所示。本专利技术提供的绵羊单核苷酸多态性标记在绵羊眼肌性状预测中的应用，具体是用 上述的引物对绵羊的总DNA进行PCR扩增，然后再对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检 测，确定自序列表中SEQID No 1的5’端起第73位碱基为G还是A，具有G等位基因的个体 会有较大的眼肌面积和眼肌宽度，也即GG、GA基因型的个体的眼肌面积和宽度显著性的大 于AA基因型。所述单核苷酸多态性检测的方法为DNA测序、聚合酶链式反应_限制性酶切位点 长度多态性、聚合酶链式反应_单链构象多态性或等位基因特异的寡核苷酸杂交。优选为聚合酶链式反应-限制性酶切位点长度多态性。其中限制性内切酶选用Nsi I。本专利技术还提供含有SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所述引物的用于单核苷酸多态性 预测绵羊眼肌性状的试剂盒。该试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、灭菌双 蒸水。该试剂盒还可包括限制性内切酶Nsi I及其缓冲液。本专利技术利用绵羊的CAST基因的SNP突变位点进行基因型快速分型。不同的绵羊群 体存在这些多态位点上的基因型频率和基因频率存在显著差异。利用一般线性模型对CAST 基因的CAST-Sl的g. G73A的SNP位点与绵羊的生产性状进行关联分析，表明CAST-S 1的 g. G73A突变与眼肌厚度和眼肌面积存在关联，其中GG型和AG型的眼肌厚度极显著高于AA 型(P<0.01) ；GG型和AG型的眼肌面积显著高于AA型(P < 0. 05)。该多态位点的检出， 不仅为分子育种提供了新的素材，同时为绵羊眼肌性状的标记辅助选择提供科学依据。附图说明图1为CAST-Sl扩增片段的SSCP结果。图2为CAST-Sl扩增片段的测序峰图。图3为CAST-Sl扩增片段的RFLP结果。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神 和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1(1)用眼科手术剪将约0.3g肌肉组织块充分剪碎，置于1.5ml离心管中，干燥 20mino(2)在上述离心管中加入500 μ 1组织DNA提取液。(3)在上述离心管中加入RNA酶溶液至终浓度为20μ g/ml，充分混勻，37°C消化 1 2小时。(4)在上述离心管中加入蛋白酶K至终浓度为150yg/ml，充分混勻，55°C消化 12 24小时。(5)在上述离心管中加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10分钟使溶液的 两相充分混勻4°C，12000rpm离心10分钟，然后转移上清液至一个干净的离心管中。重复一次。(6)再加入用等体积的Tris饱和酚氯仿异戊醇(25 24 1)，混勻，4°C， 12000rpm离心10分钟。(7)取出上清液，转移入新的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)， 4°C, 12000rpm 离心 10 分钟。(8)取上清，加入1/10体积的3M NaAc (pH5. 2)和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀 DNA。(9)将DNA沉淀挑出，置于新的干净的1. 5ml离心管中，用90%乙醇洗涤两次。(10)将DNA自然晾干后，加入适量TE或灭菌双蒸水进行溶解，-20°C保存。共检测样本336个，小尾寒羊纯种个体36个，杜泊羊*湖羊杂交个体229个，陶赛 特羊*湖羊杂交个体71个。其中小尾寒羊纯种个体用于PCR-SSCP分析，检测多态位点；两 个杂种羊群体用于PCR-RFLP多态性大规模检测。实施例21、PCR 扩增PCR-SSCP的PCR引物如下表所示。表1 5对特异性引物序列、退火温度及目的片段长度引物引物序列片段长度 (bp)退火温度 fC)CAST-Sl5'-CTCTTGGACTTTTGAACTGTA-3 ‘ 5 ’-CCACGTGAGTATTCTAAGCA-3 ‘31051.9CAST-S25 '-CTCACGTGGCTTGATCTCTG-3 ‘ 5 '-CAAGTTGTGGGATATCAGACC-3 ‘27854.2CAST-S35 '-GAACTAGGGAGGGTCTGATA-3 ‘ 5'-CCCATTAGACAGTATCAGTGATA-3'26554.0CAST-S45'-GTACTACCTACAGACACATAGTT-3' 5'-GTACTACCTACAGACACATAGTT-3'36850.4CAST-S55'-CATGCATATGCCTGAGAT-3'25555.0_5,-CACATCTGTCAATGTCAA-3’_PCR反应扩增体系为25 μ 1，其中IOX含Mg2+的PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
一种绵羊单核苷酸多态性标记，其特征在于，自SEQ ID No 1所示序列的5’端起第73位碱基为G或者A。2.权利要求1所述的单核苷酸多态性标记在绵羊眼肌性状预测中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用序列如SEQIDNo 2和SEQ ID No 3所 示的引物对绵羊的总DNA进行PCR扩增，然后再对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测， 确定自序列表中SEQ ID No 1的5’端起第73位碱基为G还是A，具有G等位基因的个体有 较大的眼肌面积和眼肌宽度。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态性检测的方法选自DNA 测序、聚合酶链式反应-限制性酶切位点长度多态性、聚合酶链...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜立新，魏彩虹，张莉，张菊，路国彬，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11
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