本发明专利技术公开了一种微藻的选育培养方法，属于非粮饲料资源开发技术领域。其包括以下步骤：将冻存的微藻藻种在以葡萄糖为碳源的一级培养基中复苏；按5％的体积接种量将一级培养基中复苏的微藻转接至含有叠氮钠的二级培养基中培养；将微藻转移至96孔深孔板中，每孔含0.5mL微藻藻种和1.5mL以大豆糖蜜为碳源的三级培养基中培养；准备96孔深孔板，置于充满氮气的培养箱中缺氧诱导；取诱导后的藻种，分别置于pH为3‑10的深孔培养板中，继续培养；将所获得的藻种分别接种至以大豆糖蜜为碳源、尿素为氮源的四级培养基中培养；所得培养产物经烘干后，测定蛋白质含量。该方法工艺简单、污染程度低、成本低廉，适用于大规模工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于非粮饲料资源开发，具体地说，尤其涉及一种利用物理和化学诱变方法筛选微藻藻种，并利用工农业副产物为底物的微藻培养方法。。
技术介绍
1、我国是畜禽养殖大国，饲料成本在畜禽养殖成本中占重要比例，但我国饲料资源相对匮乏，尤其蛋白饲料资源长期依赖进口，导致近年来豆粕等蛋白饲料价格持续升高，成为制约我国养殖业发展的重要因素。蛋白质是动物机体的重要组成部分，目前国内市场上常规蛋白饲料种类较少、成本偏高，因此非常规蛋白饲料资源开发成为畜牧领域的研究热点之一。
2、微藻是一类富含蛋白质、脂肪等营养物质以及虾青素、角鲨烯、多不饱和脂肪酸(如dha)等活性物质的微小藻类群体，具有适应性好、易培养、成本低、资源广的优势，可作为良好的饲料原料来源。但是，微藻的培养受碳源、氮源、氧气、微量元素等多种因素影响，并且作为海洋真菌，盐度也会影响其脂肪酸组成，这极大程度限制了其规模化利用。因此，选育可利用廉价工农业副产物作为底物，易于异养培养，可大规模生产的微藻藻种，并优化相关培养工艺，对非粮蛋白饲料资源的开发具有重要科学意义和应用价值。
3、微藻培养一般使用单糖(如葡萄糖)作为碳源的培养基，但葡萄糖的价格高且营养物质单一，培养成本较高，限制其工业化生产，因此开发可利用廉价碳源底物的藻种，并优化其培养方法显得至关重要。目前藻种的诱变方法较单一，采用辐射、化学试剂等单一因素筛选藻种的效果有限，而利用基因编辑技术进行生物育种存在诸多不确定因素。因此本专利旨在利用多种复合因素诱变藻种，并筛选出对应的培养工艺。
>技术实现思路1、1、要解决的问题
2、提供一种微藻选育的方法以及与之对应的培养工艺，该方法工艺简单、污染程度低、成本低廉，适用于大规模工业化生产。
3、2、技术方案
4、为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。
5、一种微藻的选育培养方法，包括以下步骤：
6、(1)将冻存的微藻藻种在以葡萄糖为碳源的一级培养基中复苏；
7、(2)按5％的体积接种量将一级培养基中复苏的微藻转接至含有0-50mmo/l叠氮钠的二级培养基中培养；
8、(3)将步骤(2)培养基中微藻转移至96孔深孔板中，每孔含0.5ml微藻藻种和1.5ml以大豆糖蜜为碳源的三级培养基中培养；
9、(4)准备步骤(3)中同样条件的96孔深孔板，置于充满氮气的培养箱中，其他条件保持不变，缺氧诱导；
10、(5)取步骤(4)中诱导后的藻种，分别置于ph为3-10的深孔培养板中，其他条件保持不变，继续培养；
11、(6)将所获得的藻种分别接种至以大豆糖蜜为碳源、尿素为氮源的四级培养基中培养；
12、(7)所得培养产物经烘干后，测定蛋白质含量。
13、所述的微藻的选育培养方法，
14、步骤(1)中复苏的参数如下：
15、培养温度为25.0℃，转速为100r/min，培养时间为24h。
16、所述的微藻的选育培养方法，
17、步骤(2)中培养的参数如下：
18、培养温度为25℃，转速为100r/min，培养时间为24-48h。
19、所述的微藻的选育培养方法，
20、步骤(3)中培养的参数如下：
21、培养温度为25.0℃，转速为100r/min，培养时间为48h。
22、所述的微藻的选育培养方法，
23、步骤(4)中缺氧诱导的参数如下：
24、缺氧诱导的时间为24-48h。
25、所述的微藻的选育培养方法，
26、步骤(5)中继续培养的参数如下：
27、继续培养的时间为24-48h。
28、所述的微藻的选育培养方法，
29、步骤(6)中培养的参数如下：
30、培养温度为21.0-37.0℃，培养时间为24-72h。
31、所述的微藻的选育培养方法，
32、步骤(1)中所用到的一级培养基、步骤(2)中所用到的二级培养基、步骤(3)中所用到的三级培养基、步骤(6)中所用到的四级培养基均灭菌后进行后续操作；
33、步骤(1)中所用到的一级培养基、步骤(2)中所用到的二级培养基、步骤(3)中所用到的三级培养基、步骤(6)中所用到的四级培养基包括碳源、蛋白胨、酵母提取物及海水晶。
34、所述的微藻的选育培养方法，
35、步骤(1)中所用到的一级培养基的参数如下：
36、葡萄糖8g/l、蛋白胨4g/l、酵母提取物4g/l及海水晶20g/l。
37、步骤(2)中所用到的二级培养基的参数如下：
38、含0、5、10、20、30、40、50mmo/l叠氮钠，葡萄糖8g/l、蛋白胨4g/l、酵母提取物4g/l及海水晶20g/l。
39、所述的微藻的选育培养方法，
40、步骤(3)中所用到的三级培养基的参数如下：
41、含40％、50％、60％质量分数的大豆糖蜜，蛋白胨4g/l、酵母提取物4g/l及海水晶20g/l。
42、步骤(6)中所用到的四级培养基的参数如下：
43、含0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％的尿素，含50％、60％质量分数的大豆糖蜜、酵母提取物4g/l及海水晶20g/l。
44、3、有益效果
45、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
46、利用多通量技术，分别通过叠氮钠、缺氧、ph变化分阶段诱导藻种，可在避免辐射和有毒物质使用的同时，筛选出符合生产需要的微藻藻种。对比筛选出的藻种对大豆糖蜜的利用效率，为微藻对工农业副产物的利用提供依据。结合尿素作为氮源，贴近粪污处理条件，可为畜禽养殖中粪污处理提供新的参考。
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【技术保护点】
1.一种微藻的选育培养方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
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9.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
10.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种微藻的选育培养方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的微藻的选育培养方法，其特征在于：
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【专利技术属性】
技术研发人员：伍树松，蒋亦轩，张雯韬，刘杨洋子，马思奇，宫嘉泰，李祯，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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