【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学和细胞生物学领域，具体涉及一种制备非基因操作car-免疫细胞的方法及制得的car-免疫细胞和其的应用。
技术介绍
1、近年来，细胞免疫疗法已成为治疗癌症的一种很有前景的方法，这些疗法利用免疫系统的能力来清除外来病原体，并将反应定向到肿瘤相关抗原(taa)。表达嵌合抗原受体(car)的细胞代表了一种主要的细胞免疫疗法，它可以控制免疫细胞识别taa并启动靶向抗肿瘤反应。car-t已经在许多血液系统恶性肿瘤中显示了显著的临床疗效。
2、car-t细胞药物与传统药物相比具有显著的优点。首先，car-t细胞能够精准靶向肿瘤，具有很好的特异性；其次，car-t细胞能够在体内长期存活，发现肿瘤之后能够快速做出反应，将肿瘤消灭。目前car-t细胞主要用于治疗血液系统的恶性肿瘤。
3、目前的car-t细胞的制作流程通常是分离患者的t细胞，利用包装好的病毒工具对t细胞进行基因编辑，将car基因插入到细胞染色体中，体外扩增car-t细胞并进行细胞功能和质量验证。待car-t细胞的质量合格之后，car-t细胞产品运往医院并回输到患者体内进行肿瘤治疗。在这个过程，目前的car-t细胞产品的制作存在两大缺点。首先，外源基因插入到个体病人的t细胞的基因组中，具有遗传风险和限制了通用性。其次，car-t细胞产品的整个制作复杂，耗时，失败率较高。这两个缺点最终导致car-t细胞产品价格过高。
4、通用型car-t细胞是“摆在货架上的药品”可以提前规模化量产，能够回输给不同的患者，可以大幅度降低car-t细胞
5、car-t细胞上的car蛋白或car元件的本质是有活性的蛋白质。这些蛋白质具有功能，能够识别肿瘤相关抗原，并能传递细胞信号导致t细胞的基因表达发生变化，从而使t细胞能够识别肿瘤细胞并表达颗粒酶等蛋白杀死肿瘤细胞。根据基本的细胞生物学原理，外泌体等带有膜结构的微小囊泡能够在细胞之间传递物质和细胞活性蛋白质。浙江大学发表的论文显示，甚至植物细胞中的类囊体转入人体细胞，其中的叶绿素蛋白还有活性，能够进行光合作用。本专利技术跳出传统思路，以293t或其他易于转染的细胞系作为car-免疫母细胞，通过基因克隆等手段改造这些细胞的基因，使其源源不断地产生带有car蛋白的外泌体、胞外囊泡、纳米囊泡或细胞膜碎片。该膜结构带有活性的car元件与普通免疫细胞进行膜融合，从而使普通的免疫细胞装配car分子，使其转变为car-免疫细胞。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种制备非基因操作car-免疫细胞的方法及制得的car-免疫细胞和其的应用，所述car-免疫细胞本身不经过基因改造，其内部的基因组没有插入外源基因，安全性好。
2、本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：
3、本专利技术提供了一种制备非基因操作car-免疫细胞的方法，包括以下步骤：
4、(1)构建car母细胞；
5、(2)扩增培养car母细胞并制备膜材料；
6、(3)目的免疫细胞的活化和扩增；
7、(4)将步骤(2)中所制备的膜材料与目的免疫细胞进行膜融合；
8、(5)分选出car-免疫细胞。
9、进一步的，在步骤(1)中，所述car母细胞为能分泌car蛋白到细胞膜的car细胞，所述car蛋白包含跨膜结构域和抗体scfv结构域。
10、进一步的，在步骤(2)中，所述膜材料包括但不限于car母细胞分泌的外泌体、胞外囊泡、细胞膜，细胞膜碎片。
11、进一步的，所述膜材料的制备方法包括但不限于外泌体的分离纯化、胞外囊泡的分离纯化、car母细胞破碎获得细胞膜碎片、car母细胞挤压获得细胞膜碎片。
12、进一步的，在步骤(3)中，所述免疫细胞包括但不限于外周血细胞和脐带血细胞，所述扩增所采用的培养基包括lonza x-vivo 15培养基。
13、进一步的，在步骤(4)中，所述膜融合的方法包括但不限于通过化学试剂改变膜状态实现包含car蛋白的膜材料与目的免疫细胞进行膜融合。
14、进一步的，所述化学试剂包括peg1450溶液。
15、本专利技术还提供了一种利用所述方法制备得到的car-免疫细胞。
16、本专利技术还提供了一种组合物，所述组合物包括所述的car-免疫细胞。
17、本专利技术还提供了一种所述的car-免疫细胞或所述的组合物在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
18、其中，本专利技术中组合物包括car-免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，本专利技术所述的通用型car-免疫细胞可用于预防和/或治疗癌症的药物组合剂或制剂。
19、所述的car-免疫细胞本身不经过基因改造，其内部的基因组没有插入外源基因，安全性好。所述的car-免疫细胞上的car元件来源于car母细胞的膜材料，包含针对靶细胞表面抗原的嵌合抗原受体和其他共刺激基团，通用性好，可以构建通用性car-免疫细胞。
20、本专利技术中car-免疫细胞基因中表达的car基因针对的抗原靶点选自cd19、cd22、cd20、cd7、cd5、cd4、cd123、cd30、cd33、cd70、cd38、cd138、bcma、slamf7、psma、her2、her3、b7-h3、mesothelin、cs1、muc16、gd2、gucy2c、ror1、gpc3、fap、folr1、cea、cd138、cd56、cd147、epcam、caix、egfr、claudin 18.2、claudin6、cll-1、gprc5d、nectin-4、egfrviii、lewisy、dll3、upar、mg7和il13rα2中的一个或多个
21、本专利技术有益效果在于：
22、慢病毒改造的car母细胞表达car元件到细胞膜上，来自该细胞的外泌体、胞外囊泡、细胞囊泡、细胞碎片将car元件转移到目标免疫细胞上制备car-免疫细胞。该方法免去了免疫细胞的基因编辑和细胞是筛选的步骤，而且可以实现多个car元件组合到一种免疫细胞上，构建多car免疫细胞。本专利技术中通用car-免疫细胞的基因组没有经过基因编辑处理，安全性高，并且简化了生产工艺，节省了生产成本，在肿瘤免疫细胞治疗领域具有巨大的应用价值。
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1.一种制备非基因操作CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备非基因操作CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述CAR母细胞为能分泌CAR蛋白到细胞膜的CAR细胞，所述CAR蛋白包含跨膜结构域和抗体scFv结构域。
3.根据权利要求1所述的制备非基因操作CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述膜材料包括但不限于CAR母细胞分泌的外泌体、胞外囊泡、细胞膜，细胞膜碎片。
4.根据权利要求3所述的制备非基因操作CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，所述膜材料的制备方法包括但不限于外泌体的分离纯化、胞外囊泡的分离纯化、CAR母细胞破碎获得细胞膜碎片、CAR母细胞挤压获得细胞膜碎片。
5.根据权利要求1所述的制备非基因操作CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述免疫细胞包括但不限于外周血细胞和脐带血细胞，所述扩增所采用的培养基包括Lonza x-vivo 15培养基。
6.根据权利要求1所述的制备非基因操作CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，在步
7.根据权利要求6所述的制备非基因操作CAR-免疫细胞的方法，其特征在于，所述化学试剂包括PEG1450溶液。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述方法制备得到的CAR-免疫细胞。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求8所述的CAR-免疫细胞。
10.如权利要求8所述的CAR-免疫细胞或权利要求9所述的组合物在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种制备非基因操作car-免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备非基因操作car-免疫细胞的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述car母细胞为能分泌car蛋白到细胞膜的car细胞，所述car蛋白包含跨膜结构域和抗体scfv结构域。
3.根据权利要求1所述的制备非基因操作car-免疫细胞的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述膜材料包括但不限于car母细胞分泌的外泌体、胞外囊泡、细胞膜，细胞膜碎片。
4.根据权利要求3所述的制备非基因操作car-免疫细胞的方法，其特征在于，所述膜材料的制备方法包括但不限于外泌体的分离纯化、胞外囊泡的分离纯化、car母细胞破碎获得细胞膜碎片、car母细胞挤压获得细胞膜碎片。
5.根据权利要求1所述的制备非基因操作car-免疫细胞的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：田庆常，王淑玲，胡静，钟璐熠，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：
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