【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品检测领域，具体涉及到一种基于crispr-cas14a检测乳中金黄色葡萄球菌的方法。
技术介绍
1、目前为止，人类鉴定出超过250种不同的食源性疾病，主要由致病微生物引起，包括多种食源性细菌，病毒和寄生虫。食源性致病菌主要通过污染肉类、奶类、乳制品和生鲜果蔬等食品感染人类，其感染后主要症状有：恶心、呕吐、腹痛、腹部痉挛、腹泻、发烧等，严重的有可能出现尿毒症，甚至造成死亡。因此，食源性致病菌的检测对于防止其危害具有重要意义。
2、目前，最常用的致病菌检测的方法主要有三种：传统的微生物平板计数法、酶联免疫法(elisa)和聚合酶链反应(pcr)。微生物平板计数法是检测金黄色葡萄球菌的"金标准"；然而，这种检测方法通常需要2-3天或更长的时间。酶联免疫测定(elisa)可将分析时间缩短至24小时，但这种技术的灵敏度不够，无法检测到低水平的病原体。聚合酶链反应扩增(pcr)是在dna层面检测金黄色葡萄球菌的方法，具有较高的灵敏度和选择性，但由于扩增的是无活力或死亡的细胞，可能会导致假阳性结果。
3、因此，建立简便、快速、高效和成本低廉的致病菌(金黄色葡萄球菌)的检测方法，成为目前食品现场快速检测的迫切需求。
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
3、因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种基于crispr-cas14a检测乳中金黄色葡萄球菌的方法。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种基于crispr-cas14a检测乳中金黄色葡萄球菌的方法，包括，
5、制备mil-101(cr)/ppy@au纳米复合材料悬浮液；
6、制备pcn-222@aupt纳米酶；
7、将玻碳电极gce表面抛光，将mil-101(cr)/ppy@au悬浮液滴涂在抛光好的gce表面，得到mil-101(cr)/ppy@au/gce；
8、将p-ssdna添加到mil-101(cr)/ppy@au/gce上，孵育得到p-ssdna/mil-101(cr)/ppy@au/gce生物传感器；
9、取cdna和适配体溶液混合，加入杂交缓冲液，孵育、退火处理到室温，再次孵育得到适配体/cdna复合物；
10、将含有金黄色葡萄球菌活菌待测物添加到适配体/cdna复合物中形成混合液，将混合液离心，取上清液加入至cas14a/sgrna复合物中，孵育获得激活的crispr/cas14a体系；
11、将激活的crispr/cas14a体系添加至p-ssdna/mil-101(cr)/ppy@au/gce生物传感上反应后，将pcn-222@aupt悬浮液添加至生物传感表面，孵育后用无菌无酶水冲洗后，将所得电极浸入含有1.0mm h2o2的pbs溶液，置于电化学工作站的三电极系统中，通过dpv法测量电极的电化学信号；其中，通过控制金黄色葡萄球菌活菌的浓度，利用上述方法测量电极的电化学信号响应值，建立电流信号响应值与金黄色葡萄球菌浓度的对数值的线性关系；
12、将待测乳预处理后，通过上述处理方法测得电极的电化学信号，代入所述线性关系中，实现乳内金黄色葡萄球菌浓度的检测。
13、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述制备mil-101(cr)/ppy@au纳米复合材料悬浮液，包括，
14、将5.0g的mil-101(cr)、0.85g的pvp和40ml的乙醇与210ml的双蒸水混合，室温下超声10min后，加入0.3ml的吡咯单体，室温下搅拌20min；
15、然后，加入3.29g的(nh4)2s2o8并持续反应4h，制得混合液；
16、将50mlaunps加入到上述混合液中，25℃下搅拌10～12h后，离心，洗涤即得到mil-101(cr)/ppy@au纳米复合材料。
17、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述制备pcn-222@aupt纳米酶，包括，
18、将200mg的zrocl2·8h2o和50mg的tcpp分散在50ml的dmf和4ml的乙酸混合液中；
19、将所得混合物在120℃下保存48h，然后用dmf、双蒸水和乙醇洗涤三次，真空干燥12h，得到紫色粉末pcn-222；
20、将20mg的pcn-222超声分散到20ml的双蒸水中，加入20ml的0.05mol/l的nabh4溶液，室温下搅拌20min，制得搅拌混合液；
21、将10ml的h2ptcl6·6h2o溶液和10ml的haucl4·3h2o溶液滴入搅拌混合液中，室温下搅拌20～30min，加入4ml的nabh4溶液，室温下搅拌30min；
22、所得混合液经离心、洗涤、干燥后获得pcn-222@aupt纳米酶。
23、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述将mil-101(cr)/ppy@au悬浮液滴涂在抛光好的gce表面，其中，mil-101(cr)/ppy@au悬浮液的浓度为1.0mg/ml，添加量为5～15μl。
24、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述将p-ssdna添加到mil-101(cr)/ppy@au/gce上，其中，p-ssdna的浓度为10μm，p-ssdna的修饰量为15μl。
25、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述cas14a/sgrna复合物，其中，cas14a和sgrna的浓度比为1:1.5。
26、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述将激活的crispr/cas14a体系添加至p-ssdna/mil-101(cr)/ppy@au/gce生物传感上反应，其中，反应温度为37℃，反应时间为45min。
27、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述将电极浸入pbs溶液，其中，pbs浓度为0.1m，含1.0mm的h2o2，ph＝7.2；所述将pcn-222@aupt悬浮液添加至生物传感表面，其中，pcn-222@aupt悬浮液的浓度为1.0mg/ml。
28、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述通过dpv法测量电极的电化学信号，其中，dpv的测量参数为：
29、检测溶液为ph7.2、含有1.0mm h2o2的0.1m pbs溶液；
30、测量电位-0.2～0.6v，脉冲幅度为0.05v，脉宽0.05s，脉冲周期0.5s。
31、作为本专利技术所述方法的一种优选方案，其中：所述待测乳包括牛奶和羊奶。
32、本专利技术有益效果：
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1.一种基于CRISPR-Cas14a检测乳中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括，
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述制备MIL-101(Cr)/PPy@Au纳米复合材料悬浮液，包括，
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述制备PCN-222@AuPt纳米酶，包括，
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将MIL-101(Cr)/PPy@Au悬浮液滴涂在抛光好的GCE表面，其中，MIL-101(Cr)/PPy@Au悬浮液的浓度为1.0mg/mL，添加量为15μL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将P-ssDNA添加到MIL-101(Cr)/PPy@Au/GCE上，其中，P-ssDNA的浓度为10μM，P-ssDNA的修饰量为10～15μL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cas14a/sgRNA复合物，其中，Cas14a和sgRNA的浓度比为1:1.5。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将激活的CRISPR/Cas14a体系添加至P-ssD
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将电极浸入PBS溶液，其中，PBS浓度为0.1M，含1.0mM的H2O2，pH＝7.2；所述将PCN-222@AuPt悬浮液添加至生物传感表面，其中，PCN-222@AuPt悬浮液的浓度为1.0mg/mL。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述通过DPV法测量电极的电化学信号，其中，DPV的测量参数为：
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测乳包括牛奶和羊奶。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas14a检测乳中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括，
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述制备mil-101(cr)/ppy@au纳米复合材料悬浮液，包括，
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述制备pcn-222@aupt纳米酶，包括，
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将mil-101(cr)/ppy@au悬浮液滴涂在抛光好的gce表面，其中，mil-101(cr)/ppy@au悬浮液的浓度为1.0mg/ml，添加量为15μl。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将p-ssdna添加到mil-101(cr)/ppy@au/gce上，其中，p-ssdna的浓度为10μm，p-ssdna的修饰量为10～15μl。
6.如权利要求1所述的方法，其特...
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