一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法技术

一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法，涉及硫酸酯酶。提供一种烷基型硫酸酯酶ＳｄｓＡ及制备方法，以及烷基型硫酸酯酶基因ｓｄｓＡ。烷基型硫酸酯酶ＳｄｓＡ的生产菌株为假单胞菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ?ｓｐ．Ｓ９。制备时，克隆烷基型硫酸酯酶基因ｓｄｓＡ，将烷基型硫酸酯酶基因ｓｄｓＡ插入表达载体，构建携带烷基型硫酸酯酶基因ｓｄｓＡ的重组表达载体；将烷基型硫酸酯酶基因ｓｄｓＡ的重组表达载体转化到大肠杆菌ＢＬ２１中，选取阳性克隆于培养基中培养；离心收集发酵后的大肠杆菌ＢＬ２１细胞，重悬大肠杆菌ＢＬ２１细胞于裂解缓冲液中，将裂解后的悬液离心，收集上清液，再与Ｎｉ－ＮＴＡ?Ａｇａｒｏｓｅ混匀，纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及硫酸酯酶，特别涉及。
技术介绍
随着去污剂的滥用，废水严重影响了水生生物的生存环境，废水处理也逐渐成为 当今社会亟待解决的问题之一。十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)作为一 种表面活性剂，广泛应用于家用清洗剂以及工业生产中。废水中的SDS因其碳链过长而不 易降解，对环境会造成一定的污染。对SDS进行生物降解的研究，在生物学、生态学和经济 上都有重要意义。烷基型硫酸酯酶(Alkylsulfatase)是硫酸酯酶(Sulfatases)(EC 3. 1. 6)中的一 种，它能够水解硫酸酯键后释放无机硫酸根和相应的醇类。烷基型硫酸酯酶能够较好地降 解表面活性剂，对废水中的表面活性剂成分进行有效的清除，即使针对不易分解的长链SDS 也能发挥作用。因此，烷基型硫酸酯酶在废水处理中扮演了重要角色。已发现的烷基型硫酸酯酶大多来源于革兰氏阴性菌中，研究最为透彻的是 Pseudomonassp. strain C12B( = NCIMB 11753 = ATCC 43648)禾口 Comamonas terrigena NCIMB 8193。在Pseudomonas sp. strain C12B菌株中，研究者发现其具有5种不同的 Alkylsulfatase(1. Bartholomew B, Dodgson KS, Gorham SD(1978)Purification and properties of the Slsecondary alkylsulphohydroIase of the detergent-degrading microorganism, Pseudomonas C12B. Biochem J 169 :659_667 ；2.Cloves JM, Dodgson KS, White GF, Fitzgerald Jff(1980)Purificationand properties of the P2 primary alkyIsulphohydroIase of the detergent-degrading bacteriumPseudomonas C12B. Biochem J 185(1) 23-31 ；3.Dodgson KS, Fitzgerald JW，Payne WJ(1974)Chemically defined inducers of alkyIsulphatases present in Pseudomonas C12B. Biochem J138 53-62)；而在 Comamonas terrigena NCIMB 8193 中只有 2 种(4. Matcham Gff, Dodgson KS(1977)Purification, properties and cellular localization of the stereospecific CS2 secondaryalkylsulphohydroIase ofComamonas terrigena. Biochem J167 (3) :723-729.)。然而这两个菌株里的Alkylsulfatase并没有在外源得到表达，因此 该酶无论是在酶量上、分离纯化方法上及其应用的广泛程度上都受到了限制。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种烷基型硫酸酯酶SdsA。本专利技术的第二个目的是提供一种烷基型硫酸酯酶基因sdsA。本专利技术的第三个目的是提供一种所述烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法。所述烷基型硫酸酯酶命名为SdsA，所述烷基型硫酸酯酶SdsA的生产菌株为假单 胞菌株Pseudomonas sp. S9，该菌株已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No. 4026。1501 GCTGAACCGA ACAATCMGC GGCAAMAAT ATGCMGCCG ACGCGCTGGA ACAGCTGGGT1561 TATCAAGCTG AGAGCGGCCC ATGGCGCAAC TTCTACCTCA CAGGTGCGCA GGAACTTCGC1621 AATGGCGTGC MCAACTTCC GACACCCGAT ACCGCAAGTC CTGACACCGT CAAGGCGATG1681 GACTTGGATT TGTTCTTCGA CTTCCTGGCC ATGCGTTTGA AAGGGCCTGA TGTTGCCGAC1741 AAGCACATCA CTCTCAACCT TGACTTTACC GATCTCAAAC AGAAGTACAC GCTCGAGATG1801 GTAAACGGTG TGCTCAACCA CACCGMGGC ATGCMGCTA AGAACGCCGA CGCGACCGTC1861 ACCTTAACGC GTGAAACCCT TAATAACGTG ATGCTAAAAC AGACCACGCT AAAAGATGCG1921 GMAGCTCAG GCGACATCAA MTCGMGGT GACAMGGCA AGCTCGAAGA GCTMTGAGC1981 TACATGGATA ACTTCGACTT CTGGTTCAAC ATTGTGACGC CATAA所述烷基型硫酸酯酶SdsA的制备方法包括以下步骤1)克隆烷基型硫酸酯酶基因sdsA，将所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA插入表达载 体，构建携带所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体；2)将所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选 取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；3)离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬所述大肠杆菌BL21细胞于裂解缓 冲液中进行裂解，将裂解后的悬液进行离心，收集上清液；4)将步骤3)所得上清液与Ni-NTA Agarose混勻，按照纯化试剂盒说明书进行纯 化，即得所述烷基型硫酸酯酶SdsA0在步骤1)中，所述表达载体可为pET-His载体。在步骤2)中，所述培养基可为含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基，所述发酵 培养的条件可为温度为37°C，摇床培养至A6tltl = 0. 6时(A6tltl为发酵液在600nm处的吸光 度值)，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为50ymol/L，16°C诱导过夜。在步骤3)中，所述裂解缓冲液的配方可为0. 3mol/L NaCl，IOmmol/L咪唑， 50mmol/LNaH2P04，去离子水定容至1L，pH 8.0。所述离心可为18000g，离心的时间可为 20mino本专利技术所述烷基型硫酸酯酶SdsA能够在大肠杆菌中稳定表达，并且纯化后的酶 活力很高，热稳定性好，具备较广的PH耐受性，可以克服现有烷基型硫酸酯酶活力低下、酶 分离纯化过程繁琐等不足，可广泛应用于降解SDS。附图说明图1为烷基型硫酸酯酶SdsA重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。在图1中，M为蛋 白Marker，l为重组载体pET-SdsA在菌株BL21中的表达(未进行诱导)，2为重组载体 PET-SdsA在菌株BL21本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烷基型硫酸酯酶ＳｄｓＡ，其特征在于所述烷基型硫酸酯酶ＳｄｓＡ的生产菌株为假单胞菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｓ９，该菌株已于２０１０年７月２０日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．４０２６；　　所述烷基型硫酸酯酶ＳｄｓＡ的氨基酸序列如下：　　１　ＭＫＬＮＡＬＳＴＡＴ　ＨＧＳＲＳＳＰＶＫＬ　ＷＫＦＳＴＳＦＬＬＡ　ＡＳＩＩＶＳＧＱＳＷ　ＡＡＥＴＡＫＰＡＴＤ　ＡＴＫＡＡＮＤＡＬＬ　　６１　ＫＥＬＰＦＤＤＫＴＳ　ＦＤＬＡＨＫＧＦＩＡ　ＰＬＰＡＥＰＩＫＧＥ　ＫＧＮＭＩＷＤＰＳＫ　ＹＧＦＩＫＥＧＥＡＡ　ＰＤＴＴＮＰＳＬＷＲ　　１２１　ＱＳＱＬＩＮＩＳＧＬ　ＦＥＶＴＤＧＩＹＱＶ　ＲＮＹＤＬＳＮＭＴＩ　ＶＥＧＫＤＧＩＴＩＦ　ＤＰＬＩＳＱＥＴＡＫ　ＡＡＬＤＬＹＹＫＨＲ１８１　ＰＫＫＰＶＶＡＶＩＹ　ＴＨＳＨＶＤＨＹＧＧ　ＶＲＧＶＶＤＥＡＤＶ　ＫＡＧＫＶＫＩＹＡＰ　ＬＧＦＬＥＨＡＶＡＥ　ＮＶＭＡＧＴＡＭＳＲ　　２４１　ＲＡＳＹＭＹＧＮＬＬ　ＰＰＤＡＫＧＱＬＧＡ　ＧＬＧＴＴＴＳＡＧＴ　ＶＴＬＩＰＰＴＤＩＩＫＥＴＧＥＴＨＶＩＤ　ＧＬＴＹＥＦＭＹＡＰ　　３０１　ＧＳＥＡＰＡＥＭＬＹ　ＹＩＫＥＫＫＡＬＮＡ　ＡＥＤＳＴＨＴＬＨＮ　ＴＹＳＬＲＧＡＫＩＲ　ＤＰＬＡＷＳＫＹＬＮ　ＥＡＬＫＬＷＧＤＤＶ　　３６１　ＱＶＭＹＡＭＨＨＷＰ　ＶＷＧＮＫＥＶＲＥＱＬＳＬＱＲＤＭＹＲＹ　ＩＮＤＥＴＬＲＬＡＮ　ＫＧＹＴＭＴＥＩＡＥ　ＱＶＫＬＰＫＫＩＡＴ　　４２１　ＫＦＳＮＲＧＹＹＧＳ　ＬＮＨＮＶＫＡＴＹＶ　ＬＹＬＧＷＦＩＧＮＰ　ＡＴＬＷＥＬＰＰＡＤ　ＫＡＫＲＹＶＥＭＭＧ　ＧＡＤＡＶＬＫＫＡＫ　　４８１ＥＹＹＤＫＧＤＦＲＷ　ＶＡＥＶＶＮＨＶＶＦ　ＡＥＰＮＮＱＡＡＫＮ　ＭＱＡＤＡＬＥＱＬＧ　ＹＱＡＥＳＧＰＷＲＮ　ＦＹＬＴＧＡＱＥＬＲ　　５４１　ＮＧＶＱＱＬＰＴＰＤ　ＴＡＳＰＤＴＶＫＡＭ　ＤＬＤＬＦＦＤＦＬＡ　ＭＲＬＫＧＰＤＶＡＤ　ＫＨＩＴＬＮＬＤＦＴ　ＤＬＫＱＫＹＴＬＥＭ　　６０１　ＶＮＧＶＬＮＨＴＥＧ　ＭＱＡＫＮＡＤＡＴＶ　ＴＬＴＲＥＴＬＮＮＶ　ＭＬＫＱＴＴＬＫＤＡ　ＥＳＳＧＤＩＫＩＥＧ　ＤＫＧＫＬＥＥＬＭＳ　　６６１　ＹＭＤＮＦＤＦＷＦＮ　ＩＶＴＰ。...

【技术特征摘要】
一种烷基型硫酸酯酶SdsA，其特征在于所述烷基型硫酸酯酶SdsA的生产菌株为假单胞菌株Pseudomonas sp.S9，该菌株已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4026；所述烷基型硫酸酯酶SdsA的氨基酸序列如下1 MKLNALSTAT HGSRSSPVKL WKFSTSFLLA ASIIVSGQSW AAETAKPATD ATKAANDALL61 KELPFDDKTS FDLAHKGFIA PLPAEPIKGE KGNMIWDPSK YGFIKEGEAA PDTTNPSLWR121 QSQLINISGL FEVTDGIYQV RNYDLSNMTI VEGKDGITIF DPLISQETAK AALDLYYKHR181 PKKPVVAVIY THSHVDHYGG VRGVVDEADV KAGKVKIYAP LGFLEHAVAE NVMAGTAMSR241 RASYMYGNLL PPDAKGQLGA GLGTTTSAGT VTLIPPTDII KETGETHVID GLTYEFMYAP301 GSEAPAEMLY YIKEKKALNA AEDSTHTLHN TYSLRGAKIR DPLAWSKYLN EALKLWGDDV361 QVMYAMHHWP VWGNKEVREQ LSLQRDMYRY INDETLRLAN KGYTMTEIAE QVKLPKKIAT421 KFSNRGYYGS LNHNVKATYV LYLGWFIGNP ATLWELPPAD KAKRYVEMMG GADAVLKKAK481 EYYDKGDFRW VAEVVNHVVF AEPNNQAAKN MQADALEQLG YQAESGPWRN FYLTGAQELR541 NGVQQLPTPD TASPDTVKAM DLDLFFDFLA MRLKGPDVAD KHITLNLDFT DLKQKYTLEM601 VNGVLNHTEG MQAKNADATV TLTRETLNNV MLKQTTLKDA ESSGDIKIEG DKGKLEELMS661 YMDNFDFWFN IVTP2. 一种烷基型硫酸酯酶基因sdsA，其特征在于所述烷基型硫酸酯酶基因sdsA的序列 如下1ATGAAATTGAATGCCCTATCGACCGCAACGCATGGGAGCCGGTCATCTCCAGTCAAATTA61TGGAAATTCAGCACTTCGTTTCTGCTTGCCGCATCCATCATAGTATCTGGTCAAAGCTGG121GCTGCAGAAACAGCTAAGCCTGCAACGGATGCGACCAAAGCCGCTAACGATGCTTTGCTC181AAAGAGCTGCCATTTGACGACAAGACCTCCTTCGACTTAGCGCACAAAGGCTTTATTGCT241CCCCTGCCTGCAGAACCGATCAAAGGCGAAAAGGGCAATATGATCTGGGACCCAAGCAAA301TATGGCTTTATTAAAGAAGGTGAAGCCGCGCCGGACACGACCAACCCAAGCTTGTGGCGC361CAATCTCAACTAATCAATATTTCTGGCCTGTTTGAAGTCACCGACGGCATTTACCAAGTC421CGCAACTATGACTTGTCGAACATGACCATCGTCGAAGGCAAAGATGGCATCACCATATTC481GACCCACTGATTTCACAAGAAACAGCGAAGGCAGCGCTCGACCTGTACTACAAACATCGG541CCGAAAAAACCTGTGGTTGCAGTCATCTACACACACAGCCACGTTGACCACTACGGCGGC601GTGCGCGGTGTTGTCGATGAGGCAGATGTTAAGGCCGGCAAGGTTAAGATCTACGCACCG661TTAGGTTTCCTTGAGCACGCCGTGGCCGAGAACGTTATGGCAGGTACTGCCATGAGCCGC721CGGGCCAGCTATATGTACGGTAACCTGCTGCCGCCAGACGCCAAAGGGCAATTAGGCGCT781GGTCTGGGTACCACCACATCGGCAGGTACAGTAACGCTGATTCCACCAACCGACATCATC841AAAGAAACCGGTGAAACCCACGTAATCGACGGTCTCACTTACGAGTTCATGTATGCGCCT901GGCAGTGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮灵伟，徐洵，龙梦娴，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]