【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农作物育种，具体涉及到一种不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法。
技术介绍
1、ogu cms是ogura在发现的天然不育源萝卜(raphanus)而建立的细胞质雄性不育系统，并以其名字命名。bannerot用不断回交方法将甘蓝型油菜的细胞核导入到萝卜ogucms中，培育形成了甘蓝型油菜ogu cms不育系。萝卜胞质不育系因其不育稳定，不受温度、光敏特性影响，可以实现100％不育。因该不育胞质的恢复基因来自萝卜，在甘蓝型油菜中没有同源或等位的恢复基因，因此几乎所有的甘蓝型油菜都是其保持系。甘蓝型油菜中萝卜胞质不育系选育容易，用遗传稳定的甘蓝型油菜给萝卜胞质不育系回交5-6代就可以获得新的不育系。同样，该类型不育胞质又被成功转育到大白菜和不结球白菜、花菜和西兰花中，并在杂交种生产上得到广泛应用，这一技术难题也成为西兰花种源上的难题。但在芸薹属中萝卜胞质不育的恢复系极难找到，将萝卜中的恢复基因转育到甘蓝型油菜非常困难，所以欧洲各国普遍采用掺合杂交种的方法加以过渡利用，即在不育的杂交种中掺合20％的常规品种种子，解决其正常结实问题。法国农业研究所(inra)和pioneer hibred公司一起研究专利技术了一项专利：即向ogu cms中转入rfo基因并结合分子标记技术相继培育出双低恢复系，并选育出真正意义上的甘蓝型油菜萝卜胞质不育杂种，从而实现了甘蓝型油菜ogucms杂种的商业化生产。近年来，随着已成为欧洲和加拿大等国家和地区油菜杂种优势的主要类型，约占该应用区域甘蓝型油菜种植面积的40％以上。而我国因萝卜
2、对植物不同细胞质雄性不育系统的研究表明，细胞质雄性不育表型是由线粒体基因组的显性突变引起的。因此，不同的cms相关基因也被用来区分不同的细胞质，bonhomme等人发现orf138与ogu cms雄性不育有关；liu等人发现证明orf224是pol cms的特异性基因；landgren等人的研究证明了orf263专用于ture cms以及orf222是nap cms的关键基因；heng等人认为orf288可导致hua cms雄性不育。随着线粒体基因组测序的最新进展，人们开发了大量的线粒体标记来鉴定油菜不同的cms类型。根据对芸苔属植物线粒体基因组序列的比较测序分析，hau cms有丝分裂型不同于其他有丝分裂型。最近，线粒体序列特异性(mss)标记也被开发用来区分芸苔属不同的cms有丝分裂类型。传统的测交和细胞学研究与分子标记开发相结合，已被用来鉴定和鉴定芸苔属作物的不同不育系。
3、一般认为cms与线粒体基因组的重排有关，在许多情况下，这归因于新的开放阅读框(orfs)的产生。一些实验证据证实了cms相关的orfs与cms的发生之间的相关性。这种从线粒体到细胞核的通讯途径被定义为线粒体逆行调节(mrr)，主要在酵母和动物中得到证实。一些与花器官发育相关的abc模型基因，即核mads-box tf基因，已被证明是mrr调控的花器官同源异体转化的靶标。此外，在一些cms系统中，线粒体对其他几个核基因的影响也很大。植物线粒体dna和与细胞质雄性不育和异常生长表型相关的突变。与mtdna大小的变化相比，植物中的线粒体基因的数量相对保守，大约有60-70个基因在不同陆地植物物种的有丝分裂中发现，大多数线粒体dna是非蛋白质编码的。然而，大多数线粒体编码基因对线粒体功能和植物的正常发育至关重要。细胞质雄性不育的表型表达由核基因组中编码的线粒体cms基因和核中的育性恢复基因(rf基因)的组合控制。brown等人已经对ogu cms的rf基因进行了鉴定并命名为rfo或orf687。该基因(rfo)能够改变orf138转录后水平的表达，并且可以直接或间接地降低orf138蛋白的含量。dahan等发现rfo编码一个687个氨基酸的五肽重复(ppr)蛋白，称为orf687；ppr蛋白的功能包括rna切割、rna不稳定或翻译抑制，因此cms-rf系统对于了解植物核基因组和线粒体基因组之间的相互作用非常重要。yamagishi发现在野生和栽培萝卜中至少分布有九种orf138，同时在萝卜中存在两种或多种rf基因。近年，尽管萝卜的ogura cms系统中的cms基因orf138和rf基因rfo反复被鉴定，然而orf138和rfo之间的确切功能关系仍不清楚，ogu cms的恢复基因rfo基因在甘蓝型油菜基因组中的物理位置仍然有待进一步研究。目前，甘蓝型油菜中的萝卜胞质不育恢复基因都来之于萝卜，通过与萝卜远缘杂交或远缘杂交后代转育而来，但恢复基因都源于萝卜。而甘蓝型油菜中的萝卜胞质恢复基因在甘蓝型油菜中没有同源基因或等位基因，因此选育过程中该基因容易丢失，很难获得遗传稳定的甘蓝型油菜恢复系，且在与不育系配制杂交种过程中很难获得100％恢复的杂交f1，因此利用该不育系统配制甘蓝型油菜杂交种容易造成风险。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，本专利技术改良周期短、效率高、成本低，有效解决了萝卜胞质恢复系选育周期长、遗传不稳定以及萝卜胞质恢复系来源与萝卜恢复源的角果短、结实差的负效应问题。
2、为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，具体包括以下步骤：
3、s1、将遗传稳定的甘蓝型油菜和甘蓝型油菜萝卜胞质不育系进行测交或多代回交，得萝卜胞质杂交f1代或稳定的新萝卜胞质不育系；
4、s2、用不含萝卜胞质恢复基因的油菜双单倍体诱导系给步骤s1所得萝卜胞质杂交f1代或稳定的新萝卜胞质不育系授粉，对其后代倍性进行测定，选择四倍体可育单株进行套袋自交，然后用四倍体可育单株与遗传稳定的萝卜胞质不育系测交，得测交后代，并对四倍体可育单株进行特殊分子标记检测；
5、s3、保留步骤s2中所得测交后代中分子标记能扩增出特异条带的可育单株，连续自交直至筛选出纯合可育株系，然后与甘蓝型油菜萝卜胞质不育系测交，测交后代全可育的可育株系即为稳定的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系。
6、进一步，步骤s2中，不含萝卜胞质恢复源基因的油菜双单倍诱导系的选育方法，包括以下步骤：
7、s2-1、将两个油菜亲本材料杂交的f1代种子进行染色体人工加倍，获得加倍后的f1代植株，然后使f1代植株自交获得f2代，选择f2代植株中的可育后代自交得f3代，对f3代植株进行纯合度鉴定，选择鉴定结果显示的各单株之间分子标记图谱一致且均为两个亲本的杂交后代的单株作为纯合的早代稳定系；
8、s2-2、对步骤s1所得早代稳定系与10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，选择鉴定结果为f1代分离、f2代有稳定株系的早代稳定系，得具有孤雌生殖遗传的早代稳定系；
9、s2-3、将步骤s2所得具有孤雌生殖遗传的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交，得杂交f1代种子，将杂交f1代种子进行染色体人工本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤S2中，所述不含萝卜胞质恢复基因的油菜双单倍诱导系的选育方法，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤S2-1和步骤S2-3中，所述染色体人工加倍的方法，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一培养基由以下配比的组分组成：MS培养基1L、的6-苄基腺嘌呤0.5-1.5mg、秋水仙素30-70mg、蔗糖20-30g和琼脂8-10g，pH值为5.8-6；
5.如权利要求3所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，所述第三培养基由以下配比的组分组成：MS培养基1L、6-苄基腺嘌呤0.03-0.5mg、秋水仙素5-20mg，蔗糖20-30g和琼脂8-10g，pH值为5.8-6。
7.如权利要求1所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤S2中，采用流式细胞技术对其后代倍性进行测定。
8.如权利要求1所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤S2中，所述特殊分子标记为Bn09-1、Bn09-2和Bn09-3；
9.权利要求1-8任一项所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法所选育出的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系。
10.权利要求9所述的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系在选育强优势萝卜胞质三系杂交新品种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤s2中，所述不含萝卜胞质恢复基因的油菜双单倍诱导系的选育方法，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤s2-1和步骤s2-3中，所述染色体人工加倍的方法，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一培养基由以下配比的组分组成：ms培养基1l、的6-苄基腺嘌呤0.5-1.5mg、秋水仙素30-70mg、蔗糖20-30g和琼脂8-10g，ph值为5.8-6；
5.如权利要求3所述的不依赖恢复源的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，所述第三培养基由以下配比的组分组成：ms培养基1l、6...
【专利技术属性】
技术研发人员：付绍红，梁星宇，李云，石浩然，杨进，龚万灼，邹琼，陶兰蓉，王继胜，吴乔波，余勤，吴学明，何立川，
申请(专利权)人：成都市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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