【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物病害防治有关领域，更具体地说，涉及一种用于培养副溶血弧菌的培养基及其培养方法。
技术介绍
1、副溶血弧菌是革兰氏阴性的菌棒状、弧状、卵圆状无芽孢菌，属于弧菌属，是一种常见的病原菌。其主要的栖息地在海水中，若海水受到副溶血弧菌的污染，会导致生存在海水中的海洋生物受到感染。如果人类食用了含有副溶血弧菌污染的海鲜，如蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，会引发食物中毒。因此，研究人员对副溶血弧菌的致病性进行进一步研究。
2、李等人在2021年的研究发现副溶血弧菌在不同培养条件时其生理状态会有比较大的改变，尤其是实验室培养得到的菌体生理状态会与其在自然状态下宿主病灶部位的生理状态产生较大差异，这就造成研究人员在对副溶血弧菌生理特征及致病力进行研究时产生误差，导致实验室水平研究结果在实际应用中效果不太理想。这种纯培养出来的细菌不能完全代表自然状态下的原生态菌，因此用这种“失真菌”作为生物研究材料所得出的结论其可信度必大打折扣。
3、崔等人在2020年的研究表明，副溶血弧菌的致病性主要由以下几部分组成：在宿主表面的扩散能力、对宿主的黏附能力以及生物被膜形成能力等。其中，扩散能力可使副溶血弧菌在宿主体内外快速扩大感染面积；黏附能力可以使副溶血弧菌快速在宿主表面定殖；生物被膜形成能力可使副溶血弧菌稳定的存在于宿主体内，不易清除。实验室培养通常采用2216e培养基，培养出来的菌体无论是扩散能力、黏附能力还是生物被膜形成能力上均与自然状态下的菌体有明显的差异。如图1～3所示，以从患病海参病灶部位第一次采集的副溶
技术实现思路
1、本专利技术提供一种用于培养副溶血弧菌的培养基及其培养方法，即一种添加宿主成分的副溶血弧菌培养基及其培养方法。本专利技术旨在于专利技术出一种仿真原生态位组分强化培养基，该培养基特点是是培养的弧菌更接近于自然状态，避免出现实验室特有的“失真菌”，最大程度减少与自然生态位的差距，努力做到培养的菌和真实菌无差别，以减少因培养环境失真导致的实验结果偏差，在研究弧菌本身或者其次级代谢产物中，更接近于真实状态，使研究更准确。
2、为了达到上述目的本专利技术提供了一种用于培养副溶血弧菌的培养基，包括胰蛋白胨、酵母膏、大菱鲆肠道研磨液和陈海水，所述大菱鲆肠道研磨液和所述陈海水的体积比为(10～90):(910～990)，所述胰蛋白胨和所述大菱鲆肠道研磨液的质量体积比(g/ml)为1:(10～90)，所述胰蛋白胨和所述酵母膏的质量比为(8～10):1。
3、优选方式下，所述大菱鲆肠道研磨液是将大菱鲆肠道研磨5～8min，按液料比为(40～50):1的比例加水，3000转离心5min，取上清液，依次用0.45μm、0.22μm滤膜各过滤一次得到的，所述大菱鲆肠道研磨液的浓度为0.5～1g/ml。
4、本专利技术还提供了一种上述用于培养副溶血弧菌的培养基的制备方法，包括将胰蛋白胨、酵母膏、大菱鲆肠道研磨液和陈海水混合得到。
5、本专利技术还提供了一种上述用于培养副溶血弧菌的培养基的培养方法，包括如下步骤：
6、s1、增菌培养：将0.5～2ml菌种接种于100ml液体增菌培养基中培养3～8h后，接种于固体增菌培养基中培养3～8h，重复3～5次完成活化后，再次接种到液体增菌培养基中培养3h，得到增菌培养体系，od600为0.3～0.35。所述液体增菌培养基为3～7g胰蛋白胨、1l陈海水混合后得到。所述固体增菌培养基为液体增菌培养基按每100ml添加1g琼脂的比例混合得到。
7、s2、附着培养：将所述增菌培养体系离心，弃上清液，用1～2g虾壳粉作为接种物接种于100ml附着培养基中培养，得到附着培养体系。所述附着培养基为0.5～2g胰蛋白胨、0.1～1g虾壳粉、1l陈海水混合后得到。
8、s3、大菱鲆肠道研磨液的制备：将大菱鲆肠道研磨5～8min，按液料比为(40～50):1的比例加水，3000转离心5min，取上清液，依次用0.45μm、0.22μm滤膜各过滤一次得到的，所述大菱鲆肠道研磨液的浓度为0.5～1g/ml。
9、s4、添加大菱鲆肠道研磨液培养基培养：取出附着培养体系中附着着菌体的虾壳粉，用无菌pbs轻轻冲洗2～3次，洗去未附着到虾壳粉颗粒上的浮游菌体后，吸取液体部分，将剩余部分接种于100ml添加大菱鲆肠道研磨液培养基培养。所述添加大菱鲆肠道研磨液培养基为1g胰蛋白胨、0.2g酵母膏、10～90ml大菱鲆肠道研磨液、910～990ml陈海水混合后得到。
10、优选方式下，步骤s1所述液体增菌培养基的培养方式是摇瓶培养，转速为100～200rpm，温度为24～37℃；所述固体增菌培养基的培养方式是倒置培养，温度为24～37℃。
11、优选方式下，步骤s2所述离心转速为3000～4000rpm，离心5～15min；所述附着培养基的培养方式为静置培养，温度为24～37℃，时间为3～8h。
12、优选方式下，步骤s4所述添加大菱鲆肠道研磨液培养基的培养方式为静置培养，时间为3～8h，温度为24～37℃。
13、最优方式下，一种用于培养副溶血弧菌的培养基的培养方法，包括如下步骤：
14、s1、增菌培养：将1ml菌种接种于100ml液体增菌培养基中，转速为160rpm，摇瓶培养8h后，用接种环接种到含有100ml固体增菌培养基的培养基固体平板倒置培养5h，重复三次完成活化后，将所得菌体接种至100ml液体增菌培养基中，转速为160rpm，摇瓶培养3h，得到增菌培养体系，od600为0.3，所述增菌培养的温度为28℃。所述液体增菌培养基为5g胰蛋白胨、1l陈海水混合后得到。所述固体增菌培养基为液体增菌培养基按每100ml添加1g琼脂的比例混合得到。
15、s2、附着培养：将所述增菌培养体系离心10min，转速为3500rpm，弃上清液，用1.5g虾壳粉作为接种物接种于100ml附着培养基中，温度为28℃，静置培养3～8h，得到附着培养体系。所述附着培养基为1g胰蛋白胨、0.5g虾壳粉、1l陈海水混合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于培养副溶血弧菌的培养基，其特征在于，包括胰蛋白胨、酵母膏、大菱鲆肠道研磨液和陈海水，所述大菱鲆肠道研磨液和所述陈海水的体积比为(10～90):(910～990)，所述胰蛋白胨和所述大菱鲆肠道研磨液的质量体积比(g/mL)为1:(10～90)，所述胰蛋白胨和所述酵母膏的质量比为(8～10):1。
2.根据权利要求1所述用于培养副溶血弧菌的培养基，其特征在于，所述大菱鲆肠道研磨液是将大菱鲆肠道研磨5～8min，按液料比为(40～50):1的比例加水，3000转离心5min，取上清液，依次用0.45μm、0.22μm滤膜各过滤一次得到的，所述大菱鲆肠道研磨液的浓度为0.5～1g/mL。
3.一种如权利要求1～2所述用于培养副溶血弧菌的培养基的制备方法，其特征在于，包括将胰蛋白胨、酵母膏、大菱鲆肠道研磨液和陈海水混合得到。
4.一种如权利要求1～3所述用于培养副溶血弧菌的培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述用于培养副溶血弧菌的培养基的培养方法，其特征在于，步骤S1所述液体增菌培养基的培养方式是摇瓶
6.根据权利要求4所述用于培养副溶血弧菌的培养基的培养方法，其特征在于，步骤S2所述离心转速为3000～4000rpm，离心5～15min；所述附着培养基的培养方式为静置培养，温度为24～37℃，时间为3～8h。
7.根据权利要求4所述用于培养副溶血弧菌的培养基的培养方法，其特征在于，步骤S4所述添加大菱鲆肠道研磨液培养基的培养方式为静置培养，时间为3～8h，温度为24～37℃。
8.根据权利要求4～7任一所述用于培养副溶血弧菌的培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种用于培养副溶血弧菌的培养基，其特征在于，包括胰蛋白胨、酵母膏、大菱鲆肠道研磨液和陈海水，所述大菱鲆肠道研磨液和所述陈海水的体积比为(10～90):(910～990)，所述胰蛋白胨和所述大菱鲆肠道研磨液的质量体积比(g/ml)为1:(10～90)，所述胰蛋白胨和所述酵母膏的质量比为(8～10):1。
2.根据权利要求1所述用于培养副溶血弧菌的培养基，其特征在于，所述大菱鲆肠道研磨液是将大菱鲆肠道研磨5～8min，按液料比为(40～50):1的比例加水，3000转离心5min，取上清液，依次用0.45μm、0.22μm滤膜各过滤一次得到的，所述大菱鲆肠道研磨液的浓度为0.5～1g/ml。
3.一种如权利要求1～2所述用于培养副溶血弧菌的培养基的制备方法，其特征在于，包括将胰蛋白胨、酵母膏、大菱鲆肠道研磨液和陈海水混合得到。
4.一种如权利要求1～3所述用于培养副...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐永平，张万，徐牧，李晓宇，孙晓雯，王丽丽，葛祥武，马欣，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：
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