一种利用ＳＳＲ核心引物鉴定棉花品种的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用ＳＳＲ标记进行棉花品种鉴定的方法，属于生物技术领域。利用３２份国家和山东省已经审定的棉花品种作为样本材料，对棉花分子标记数据库中已经公布的２０００对ＳＳＲ引物进行多态性筛选，最终确立了１１对引物为棉花品种鉴定的首选核心引物，１１对首选核心引物理论上可以区分４１９９０４个品种，且出现指纹图谱相同的概率为２．３８×１０－６。利用１１对核心引物构建了３２份审定品种的ＤＮＡ指纹数据库，并利用该数据库对匿名取样品中Ａ和山东省２００９年２５份区试品系真实性进行了指纹鉴定，其鉴定结果与田间试验结果完全一致。本发明专利技术所建立的ＳＳＲ－ＤＮＡ指纹技术可快速、准确的鉴定棉花品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种利用SSR(简单重复序列，SimpleSequence Repeat，简称SSR)分子标记鉴定棉花新品种的方法。
技术介绍
准确、快速进行农作物品种的鉴定，对于农作物品种审定、品种保护、真假品种辨 别、品种的产权纠纷等方面均有重要作用。作物品种鉴定方法可分为形态学鉴定、蛋白质指 纹技术和DNA (脱氧核糖核酸，Deoxyribonucleic acid，简称DNA)指纹技术三个主要鉴定 方法。形态学鉴定方法简便、经济，但存在周期长、费工费时，调查性状受栽培条件及环 境因素影响，人为观察误差较大等缺陷。而且检测结果相对滞后，难以及时监控市场上的种 子质量问题和解决品种侵权等纠纷。并且随着农作物品种遗传基础狭窄，仅仅利用传统的 形态学方法进行农作物品种鉴定也愈来愈困难。蛋白质是基因表达的产物，品种间的遗传差异形成蛋白质的多态性，通过电泳技 术得到多态性的蛋白质指纹图谱，即蛋白质指纹鉴定技术。由于直接测定的是蛋白质，具有 快速、准确性高、重复性好的优点。1991年，国际种子检验协会把蛋白质电泳方法正式定为 标准的品种鉴定方法，从而使蛋白质指纹鉴定技术在品种真实性鉴定和种子纯度检验上占 有重要地位。根据蛋白质的特性，可将检验方法分为同工酶电泳和种子贮藏蛋白电泳两大 类，然而，同工酶分析结果常常因为所选择的酶多少和种类不同存在偏差。此外，作为基因 表达的最后产物，同工酶不能完全显示品种间的多态性，对于亲缘关系比较密切的自交系 及其杂交种难以鉴定。蛋白质是基因表达的直接产物，具有组织特异性、可利用数量少、多 态性低的特点，因而对亲缘关系较近的品种难以鉴别。DNA指纹技术是指能够反映生物个体或种群间基因组中DNA位点差异的一种分 子生物学技术。目前，DNA分子标记技术已经发展到数十种，主要可分为以下四大类第 一类是以Southern杂交为基础的分子标记技术，如限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，简称 RFLP)。第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)为基础的分子标记技术。它又分为两类，一类是使用随机引物 进行扩增，主要指随机扩增多态性DNA (Random amplified polymorphic DNA，简称RAPD)。 另一类是采用特定引物进行扩增，主要有序列特异性扩增区(Sequence characterized amplifiedregion,简称 SCAR)、序列标记位点(sequence-tagged site,简称 STS)、SSR。 第三类是基于PCR与酶切相结合的DNA分子标记技术。它又分为两类，一类是先酶切，再 用特殊设计的引物进行扩增，如扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment length polymorphism，简称AFLP)。另一类是先扩增，再酶切扩增片段，检测酶切片段的长度多态 性，如酶切扩增多态性序列(CleavedAmplified Polymorphism Sequences，简称 CAPS)。第 四类是基于单核甘酸多态性的DNA分子标记技术，如单核甘酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，简称SNP)。它们具有直接以DNA的形式表现，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；数量极多，遍布整个基因组；多态性高，无需人为创造等位变异；表现为中 性，不影响目的性状的表达等优点。国际植物品种权保护组织(The International Union for the Protection of New Varieties of Plants，简称 UPOV)在 2005 年在生物化学 和分子生物学技术(Biochemical and MolecularTechniques，简称BMT)测试指南草案中 (Guidelines (proj. 3)，3-6)，将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR和SNP，其中 SSR标记技术比较成熟。SSR是基于PCR技术的分子标记，具有以下5个优点(1)以孟德尔方式遗传，呈共 显性；(2)数量丰富，覆盖整个染色体组；(3)每个位点均有许多等位形式，多态性丰富，信 息含量高；(3)利用PCR技术分析，对DNA数量及质量要求不高；(4)实验程序简单，结果重 复性好；(5)每个位点由引物序列顺序决定，便于不同实验室相互交流合作。目前已经利用 SSR标记构建马铃薯、玉米、水稻、小麦的DNA指纹库(Moisan等，2005 Potato Research, 48(2-3) 191-200 ；王风格等，2007，分子植物育种，5 (1) 128-132 ；程本义等，2008，杂交水 稻，18 (5) 319-320 ；李根英等，2006，作物学报，32 (12) :1771_1778)，在我国以SSR标记为 基础的玉米和水稻的品种鉴定DNA指纹技术已经形成国家标准(NYT 1432-2007《玉米品种 鉴定DNA指纹方法》和NYT 1433-2007《水稻品种鉴定DNA指纹方法》)。但在我国，目前棉 花品种的鉴别仍然是形态学结合蛋白质指纹技术鉴定方法，因此急需利用SSR核心引物构 建棉花品种DNA指纹数据库，它在棉花区试品系的鉴定、品种保护、假种辨别、产权纠纷等 领域具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术以32份国家和山东省已经审定的棉花品种作为样本材料，利用棉花分子 标记数据库(Cotton Marker Database，简称CMD)中已经公布的2000对SSR引物进行多态 性筛选，以筛选出适合棉花品种鉴定的SSR核心引物，构建棉花品种的指纹数据，对匿名取 样品种和2009年参加山东省区试的品系进行真实性鉴定。32份国家和山东省已经审定的棉花品种，采用SDS(十二烷基磺酸钠，Sodium dodeyl fulfate，简称SDS)法提取棉花干种子的DNA，2000对SSR引物对32份棉花 品种DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturing Polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)作为检测平台，统计每个引物的多态性 信息量(Polymorphism information Content，简称PIC)，每对SSR位点的多态性信息量按 PIC= 1- E fi2公式计算，其中fi为i位点的基因频率(Smith et al.，1997，Theor. Appl. Genet. ,95(1-2) :163_173.)。以条带清晰，易于统计，多态性好，稳定性好作为核心引物的 标准，2000对引物中26对(表1)引物符合核心引物的筛选标准，其占总引物数量的1.3%， 其余引物没有多态性，这26对引物覆盖了棉花的22条染色体。表1经过筛选26对多态性高的SSR引物 注l、aF:正向引物 bR:反向引物2、NAU, Nanjing Agricultural University,缩写 NAU ;BNL, BrookhavenNational Laboratory本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用ＳＳＲ核心引物鉴定棉花品种的方法，其特征在于由棉花干种子提取基因组ＤＮＡ，利用１１对ＳＳＲ核心引物：ＮＡＵ１１６７，ＮＡＵ２０２６，ＮＡＵ１２６９，ＮＡＵ２２５７，ＮＡＵ１１０３，ＢＮＬ１６９４，ＮＡＵ５０４６，ＮＡＵ２０８３，ＮＡＵ２２７７，ＮＡＵ１０４３，ＮＡＵ３４６８构建３２份审定棉花品种的ＤＮＡ指纹数据库，将测试品种或品系ＤＮＡ指纹数据和已构建的棉花品种ＤＮＡ指纹数据库中的数据进行ＵＰＧＭＡ聚类分析，依据品种间Ｄｉｃｅ遗传相似系数可对测试品种或品系的真实性作出判断，遗传相似系数为１的为同一品种。

【技术特征摘要】
一种利用SSR核心引物鉴定棉花品种的方法，其特征在于由棉花干种子提取基因组DNA，利用11对SSR核心引物NAU1167，NAU2026，NAU1269，NAU2257，NAU1103，BNL1694，NAU5046，NAU2083，NAU2277，NAU...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈法富，刘峰，张友秋，徐子初，冯雪梅，赵佩，张娜，
申请(专利权)人：山东农业大学，山东鑫秋种业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]