【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种确定rna分子群体中一种或多种rna分子的拷贝数的方法以及一种确定rna分子群体中一种或多种rna分子的序列的方法,其中该方法包括通过易错逆转录将该rna分子群体转换为dna分子群体的步骤。本专利技术还涉及通过本文公开的方法获得的或可获得的dna分子群体。
技术介绍
1、大规模并行测序应用已经改变了生物学和医学。为了研究细胞群体甚至单细胞中的遗传程序,如今对数千至数百万个个体单细胞或细胞群体进行rna测序已成为惯例。此类分析可以揭示跨细胞类型和状态的基因、同种型和等位基因表达的模式。然而,当前的短读长单细胞rna测序(scrna-seq)方法在等位基因和同种型分辨率下计数rna的能力有限,而长读长测序技术对于跨细胞大规模应用所需的深度来说过于昂贵。
2、大多数scrna-seq方法通过对唯一分子标识符(umi)和一小部分rna(从5'或3'末端开始)进行测序来计数rna。这些rna末端计数策略在估计大量细胞的基因表达时一直是有效的,同时控制pcr扩增偏差,但rna末端测序对转录遗传变异和转录同种型表达的覆盖
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1.一种用于确定RNA分子群体中一种或多种RNA分子的拷贝数的方法,其包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括在步骤(ii)之后进行的以下步骤:
3.一种用于确定RNA分子群体中一种或多种RNA分子的序列的方法,其包括以下步骤:
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述方法进一步包括在步骤(ii)之后进行的以下步骤:
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述RNA分子群体包括具有不同序列的RNA分子和/或具有相同序列的RNA分子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于确定rna分子群体中一种或多种rna分子的拷贝数的方法,其包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括在步骤(ii)之后进行的以下步骤:
3.一种用于确定rna分子群体中一种或多种rna分子的序列的方法,其包括以下步骤:
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述方法进一步包括在步骤(ii)之后进行的以下步骤:
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述rna分子群体包括具有不同序列的rna分子和/或具有相同序列的rna分子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所分析的所述rna分子群体包括1至100,000,000,000个个体rna分子、优选地100至1,000,000,000,000个个体rna分子、更优选地1,000至1,000,000,000个个体rna分子、最优选地100,000至100,000,000个个体rna分子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述rna分子群体包括一种或多种选自由以下项组成的组的rna分子:信使rna(mrna)、前体mrna(pre-mrna)、反义rna(asrna)及其前体、增强子rna及其前体、长非编码rna(lncrna)及其前体、微rna(mirna)及其前体、核糖体rna(rrna)及其前体、转运rna(trna)及其前体、组蛋白rna及其前体、小核仁rna(snorna)及其前体、小核rna(snrna)及其前体、线粒体rna及其前体、病毒rna、转座子rna、合成rna、体外转录的rna或它们的组合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(ii)包括以约0.5%至约99.5%的总比率、更优选地以约2%至约98%、还更优选地以约5%至约95%、还更优选地以约5%至约50%、还更优选地以约5%至约20%、最优选地以约15%至约30%的比率将一种或多种碱基转换引入每种dna分子中。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(ii)包括在存在一种或多种碱基类似物的情况下的逆转录。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述一种或多种碱基类似物选自由以下项组成的组:2'-脱氧-p-核苷-5'-三磷酸(dptp);8-氧代-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸(8-氧代-gtp);2-硫代胸苷-5'-三磷酸(2-硫代ttp)、5-甲酰基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-炔丙基氨基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、或它们的组合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(ii)包括在存在次优量的一种或多种dntp碱基的情况下的逆转录。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法包括在步骤(i)之前将一种或多种碱基类似物掺入所述rna分子群体中的所述一种或多种rna分子中。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述一种或多种碱基类似物是4-硫代-尿苷。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(ii)进一步包括在对所述rna分子群体进行逆转录之前,对所述rna分子群体进行化学修饰的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法,其中对所述rna分子群体进行化学修饰的步骤包括烷基化所述rna分子群体,任选地其中所述烷基化是通过碘乙酰胺处理或氧化亲核芳族取代进行的。
16.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中步骤(ii)进一步包括对通过逆转录产生的所述dna分子群体进行化学修饰的步骤。
17.根据权利要求14或16所述的方法,其中所述化学修饰包括脱氨基反应。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(ii)包括使用易错逆转录酶的逆转录。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(iii)包括扩增来自步骤(ii)的所述dna分子群体以产生所述群体中的每种dna分子的一个或多个扩增子的步骤。
20.根据权利要求19...
【专利技术属性】
技术研发人员:G·J·亨德里克斯,J·A·M·拉尔森,T·R·H·桑德伯格,
申请(专利权)人:基础基因组学公司,
类型:发明
国别省市:
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