【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制品，具体涉及一种基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
1、以病原体抗原表位构建的肽疫苗可以诱导更为精准的针对病原微生物的免疫反应。此外，肽疫苗通过化学手段制备，生产成本低，可根据病原体突变信息快速调整疫苗组成，从而快速应对病原体突变带来的危害。由于b细胞受体的差异是在细胞水平，对于b细胞表位而言，一种病原体的b细胞表位有可能在不同的个体内引起b细胞活化。但是由于人类主要组织相容性复合物，负责呈递t细胞表位，存在个体差异，很难从病原体中筛选能够在大多数人体中都能有效诱导抗原特异性t淋巴细胞活化的t细胞表位(包括cd4+和cd8+t细胞表位)。因此，目前肽疫苗主要利用b细胞表位构建。然而，仅靠b细胞表位难以诱导高效的体液免疫反应。这是因为b细胞活化成为抗体分泌细胞不仅需要多价抗原引发b细胞受体交联，还需要活化的th2型辅助性cd4阳性t细胞，为b细胞提供cd40配体，而b细胞表位通常无法诱导t细胞活化。
2、目前，为了使b细胞表位具有免疫原性，一般将b细胞表位通过交联剂偶联在外源性的载体蛋白(例如ova，bsa，klh)上，利用载体蛋白中的t细胞表位活化cd4阳性t细胞，从而诱导有效的体液免疫。也有研究表明，将病原体的b细胞表位和一种所谓的通用型t细胞表位结合起来，可以有效增强体液免疫。尽管上述方式构建的肽疫苗有可能引起广泛的体液免疫反应，但是无法诱导病原体抗原特异性的cd4+t细胞活化，从而无法产生针对病原体的记忆性cd4+t淋巴细胞，影响疫苗预防效果。此外
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，以框架核酸为递送载体，将来自病毒的b细胞表位和蛋白亚基重新进行精确组织，构建一种普遍适用的能够同时诱导高效体液免疫和细胞免疫的新型疫苗。
2、本专利技术提供了一种基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，以dna链组装形成的四面体框架核酸为载体，在所述四面体框架核酸的一个棱上偶联有引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原，在所述四面体框架核酸的4个顶点处偶联病毒的b细胞表位肽。
3、优选的，四面体框架核酸组装用dna链的核苷酸序列如seq id no:1～seq id no:8所示。
4、优选的，所述病毒的b细胞表位肽通过巯基修饰的dna链与四面体框架核酸顶点上伸出的单链dna进行杂交；
5、所述巯基修饰的dna链的核苷酸序列如seq id no:9所示。
6、优选的，所述引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原通过偶联的dna链与四面体框架核酸的棱上伸出的单链dna进行杂交；
7、所述偶联的dna链的核苷酸序列如seq id no:10所示。
8、优选的，所述引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原和dna链是通过halo tag和halo ligand进行偶联。
9、优选的，所述病毒包括以下至少一种病毒：冠状病毒、人类免疫缺陷病毒多肽疫苗、呼吸道合胞病毒多肽疫苗和流感病毒。
10、优选的，所述冠状病毒包括新型冠状病毒及其变异株；
11、所述新型冠状病毒或其变异株中引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原包括n蛋白；
12、新型冠状病毒或其变异株的b细胞表位肽包括s3404-412和/或s4440-445。
13、本专利技术提供了所述基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
14、将四面体框架核酸组装用dna链进行第一杂交反应，得到四面体框架核酸；
15、将巯基修饰的dna链与马来酰亚胺修饰的病毒的b细胞表位肽混合进行偶联反应，得到偶联dna的b细胞表位肽；
16、将halo tag修饰的引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原和halo ligand修饰的dna链共价偶联，得到偶联dna的蛋白抗原；
17、将四面体框架核酸、dna偶联的b细胞表位肽和dna偶联的蛋白抗原
18、进行第二杂交反应，得到病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗。
19、优选的，在所述第一杂交反应中，四面体框架核酸组装用dna链按照等摩尔比混合，在95℃下处理10min，再在4℃保持30min；所述四面体框架核酸组装用dna链的每条dna链的终浓度独立为0.8～1.2μm；
20、在所述偶联反应中，所述巯基修饰的dna链与马来酰亚胺修饰的病毒的b细胞表位肽的摩尔比为1:(2～10)；
21、在所述共价偶联中，halo tag修饰的引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原和halo ligand修饰的dna链的摩尔比为(0.9～1.1)：(0.9～1.1)；
22、在所述第二杂交反应中，所述四面体框架核酸、dna偶联的b细胞表位肽和dna偶联的蛋白抗原的摩尔比为(0.9～1.1)：(3.9～4.1)：(0.9～1.1)。
23、本专利技术提供了所述基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗或所述制备方法得到的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗在制备免疫动物模型中的应用；
24、优选的，所述免疫动物模型包括至少一种：大鼠、小鼠和兔子。
25、本专利技术提供了一种基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，以dna链组装形成的四面体框架核酸为载体，在所述四面体框架核酸的一个棱上偶联有引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原，在所述四面体框架核酸的4个顶点处偶联病毒的b细胞表位肽。通过系统免疫评价，结果表明，将sars-cvo-2 n蛋白偶联在四面体框架核酸上可以在多种动物模型中，包括c57，babl/c小鼠、大鼠和兔子，引起cd4+t细胞活化，从而有效提高b细胞表位的免疫效果，诱导产生更高的抗体滴度，以及记忆性b细胞和t细胞比例的增加。此外，我们惊喜地发现与游离n蛋白相比，将n蛋白整合在四面体上可以诱导更强的cd8阳性t细胞活化，这是可能因为四面体促进了抗原交叉呈递。可见，本专利技术提供的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗以四面体框架核酸作为运送载体可以有效递送n蛋白到t细胞，增强抗原特异性b细胞-t细胞结合，使b细胞获取更多的cd40l刺激，为构建基于蛋白载体的高效病毒肽疫苗提供全新的思路。
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1.一种基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，以DNA链组装形成的四面体框架核酸为载体，在所述四面体框架核酸的一个棱上偶联有引起病毒特异性T细胞活化的蛋白抗原，在所述四面体框架核酸的4个顶点处偶联病毒的B细胞表位肽。
2.根据权利要求1所述基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，四面体框架核酸组装用DNA链的核苷酸序列如SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求1所述基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，所述病毒的B细胞表位肽通过巯基修饰的DNA链与四面体框架核酸顶点上伸出的单链DNA进行杂交；
4.根据权利要求1所述基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，所述引起病毒特异性T细胞活化的蛋白抗原通过偶联的DNA链与四面体框架核酸的棱上伸出的单链DNA进行杂交；
5.根据权利要求4所述基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，所述引起病毒特异性T细胞活化的蛋白抗原和DNA链是通过Halo tag和H
6.根据权利要求1所述基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，所述病毒包括以下至少一种病毒：冠状病毒、人类免疫缺陷病毒多肽疫苗、呼吸道合胞病毒多肽疫苗和流感病毒。
7.根据权利要求6所述基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，所述冠状病毒包括新型冠状病毒及其变异株；
8.权利要求1～7中任意一项所述基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，在所述第一杂交反应中，四面体框架核酸组装用DNA链按照等摩尔比混合，在95℃下处理10min，在4℃保持30min；所述四面体框架核酸组装用DNA链的每条DNA链的终浓度独立为0.8～1.2μM；
10.权利要求1～7中任意一项所述基于DNA纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗或权利要求8或9所述制备方法得到的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗在制备免疫动物模型中的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，以dna链组装形成的四面体框架核酸为载体，在所述四面体框架核酸的一个棱上偶联有引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原，在所述四面体框架核酸的4个顶点处偶联病毒的b细胞表位肽。
2.根据权利要求1所述基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，四面体框架核酸组装用dna链的核苷酸序列如seq idno:1～seq id no:8所示。
3.根据权利要求1所述基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，所述病毒的b细胞表位肽通过巯基修饰的dna链与四面体框架核酸顶点上伸出的单链dna进行杂交；
4.根据权利要求1所述基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，所述引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原通过偶联的dna链与四面体框架核酸的棱上伸出的单链dna进行杂交；
5.根据权利要求4所述基于dna纳米技术的病毒多肽-蛋白亚单位组合疫苗，其特征在于，所述引起病毒特异性t细胞活化的蛋白抗原和dna...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙乐乐，张运龙，曲彦霏，张亚玲，延玲玲，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
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