【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物合成，具体涉及利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法及其构建的工程菌。
技术介绍
1、谱劳诺托(plaunotol)是一种具有重要药物活性的无环二萜醇，据文献报道，谱劳诺托具有抗炎的功效，包括对幽门螺杆菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌和卡氏莫拉克菌的抗炎活性和抗微生物活性。谱劳诺醇对导致消化性溃疡的幽门螺杆菌具有良好的抗菌活性，能够抑制肿瘤血管生成和细胞的增殖活性，也可以可作为一种潜在的抗结肠癌的抗癌剂。谱劳诺托最初是在遍布东南亚的热带植物巴豆(croton stellatopilosus)的茎和叶中发现的。然而，通过植物提取生产的谱劳诺醇产量低，植物生长周期长，限制了产量。
2、谱劳诺托具有较大的研究和应用价值，然而受限于生产工艺和规模，价格居高不下，使得谱劳诺托的应用受到限制。
技术实现思路
1、本专利技术提供利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，基于生物合成的思路，以大肠杆菌mg1655为底盘细胞，在大肠杆菌细胞内构建谱劳诺托的生物合成途径，将外源mva途径的全部基因插入大肠杆菌mg1655中，构建谱劳诺醇的高效转化质粒ptrc-cyp97-cpⅰ-dpp1，而后将上述重组质粒转化至大肠杆菌mg1655中，改造后的工程菌可以以葡萄糖为底物，从头合成谱劳诺醇。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术目的之一在于提供利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，将外源mva途径的全部基因插入大肠杆菌mg1655中，构建ptrc-cyp97
4、进一步地，所述方法包括以下步骤：
5、s1、将外源mva途径的全部基因整合至大肠杆菌mg1655细胞的基因组上以提高ipp和dmapp的通量；
6、s2、将基因dpp1连接到整合有mva途径全部基因的ptrc99a质粒上；再将基因cyp97和基因cprⅰ连接到ptrc99a质粒上，构建ptrc-cyp97cprⅰ-dpp1重组质粒；
7、s3、通过cacl2法处理大肠杆菌mg1655，制备成化学感受态，并通过热激转化法将ptrc-cyp97cprⅰ-dpp1转化至大肠杆菌mg1655中；
8、s4、对含有重组质粒ptrc-cyp97cprⅰ-dpp1的大肠杆菌mg1655菌株进行接种、扩大培养后，离心收集菌体备用；
9、s5、在菌体中加入50mm tris/hcl 7.5重悬并加入葡萄糖，置于30℃，220rpm摇床中以葡萄糖为底物实现从头合成谱劳诺托。
10、进一步地，所述步骤s1中外源mva途径的全部基因包含erg10、erg13、hmg1、erg12、erg8、mvd1、idi1和erg20。
11、进一步地，所述步骤s2中基因dpp1来源于酿酒酵母s288c，基因cyp97和基因cprⅰ分别来源于泰国巴豆的细胞色素p450单加氧酶cyp97c27和细胞色素p450还原酶cprⅰ。
12、进一步地，所述步骤s2重组质粒的构建步骤如下：
13、s21、依据genbank上的泰国巴豆基因组序列设计引物对cyp97c27-f/cyp97c27-r和cprⅰ-f/cprⅰ-r，以泰国巴豆的cdna为模板通过基因扩增获得cyp97c27基因和cprⅰ基因；所述基因cyp97c27的核苷酸序列如seq.id.no.1，cprⅰ基因的核苷酸序列如seq.id.no.2所示；
14、其中，引物对cyp97c27-f/cyp97c27-r的序列如下所示：
15、cyp97c27-f：cacacaggaaacagaccaaggagatgcagagcagcaccgg；
16、cyp97c27-r：ccaggcagagctcgaattccatttaccaaacatcgcgcagataacgg；
17、引物对cprⅰ-f/cprⅰ-r的序列如下所示：
18、cprⅰ-f：caggaaacaggatcggaaggagatggccaccgccaaactg；
19、cprⅰ-r：tgccgccaggcacagataaaacgattagcgactactggtcggaacaaatg；
20、s22、以酿酒酵母s288c基因组为模板，使用引物对dpp1-f/dpp1-r通过基因扩增获得大肠杆菌外源dpp1基因；所述dpp1基因的核苷酸序列如seq.id.no.3所示；
21、其中，引物对dpp1-f/dpp1-r的序列如下所示：
22、dpp1-f：tatgctagcaaggtaaggagatgaacagagtttcgtttattaaaacgcct；
23、dpp1-r：gccaggcattatcagacgagttacataccttcatcggacaaaggatgtaa；
24、s23、以ptrc99a质粒为模板，ptrc99a质粒的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，以引物对ptrc99a-v-f/ptrc99a-v-r对模板进行pcr扩增获得质粒片段；
25、其中，引物对ptrc99a-v-f/ptrc99a-v-r的序列如下所示：
26、ptrc99a-v-f：gtcgaaagactgggcctttttgtcggtgaacgctctcctg；
27、ptrc99a-v-r：gccggatgattaattgtcaacagctcatttcagaatatttgccagaaccg；
28、s24、通过gibson无缝连接技术对上述cyp97c27基因片段、cprⅰ基因片段和dpp1基因片段连接到质粒片段上形成环状质粒，该重组质粒为ptrc-cyp97cprⅰ-dpp1。
29、本专利技术的目的之二在于提供一种用于生物合成谱劳诺托的工程菌，所述工程菌以大肠杆菌mg1655为底盘细胞，大肠杆菌mg1655细胞的基因组上包含完整外源mva途径的全部基因、来源于酿酒酵母s288c的双功能二酰基甘油二磷酸磷酸酶/磷脂磷酸酶dpp1基因、来源于泰国巴豆的细胞色素p450单加氧酶cyp97c27基因和细胞色素p450还原酶cprⅰ基因。
30、进一步地，来源于酿酒酵母s288c的双功能二酰基甘油二磷酸磷酸酶/磷脂磷酸酶基因的核苷酸序列如seq.id.no.3所示；来源于泰国巴豆的细胞色素p450单加氧酶cyp97c27基因的核苷酸序列如seq.id.no.1；来源于泰国巴豆的细胞色素p450还原酶cprⅰ基因的核苷酸序列如seq.id.no.2所示。
31、本专利技术的目的之三在于提供上述用于生物合成谱劳诺托的工程菌在以葡萄糖为底物从头合成谱劳诺托中的应用。
32、相较于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
33、1、本专利技术的工程本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于，将外源MVA途径的全部基因插入大肠杆菌MG1655中，构建pTrc-cyp97-cprⅠ-dpp1载体，将重组载体转化至大肠杆菌MG1655中，改造后的工程菌以葡萄糖为底物，从头合成谱劳诺托。
2.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于：所述步骤S1中外源MVA途径的全部基因包含ERG10、ERG13、HMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1和ERG20。
4.根据权利要求2所述的利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于：所述步骤S2中基因dpp1来源于酿酒酵母S288C，基因cyp97和基因cprⅠ分别来源于泰国巴豆的细胞色素P450单加氧酶CYP97C27和细胞色素P450还原酶CPRⅠ。
5.根据权利要求2所述的利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于：所述步骤S2重组质粒的构建步骤如下：
6.一种用于生物合成谱劳诺托的工程菌，
7.根据权利要求6所述一种用于生物合成谱劳诺托的工程菌，其特征在于：来源于酿酒酵母S288C的双功能二酰基甘油二磷酸磷酸酶/磷脂磷酸酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.No.3所示；来源于泰国巴豆的细胞色素P450单加氧酶CYP97C27基因的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1；来源于泰国巴豆的细胞色素P450还原酶CPRⅠ基因的核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示。
8.一种根据权利要求6所述的用于生物合成谱劳诺托的工程菌在以葡萄糖为底物从头合成谱劳诺托中的应用。
...【技术特征摘要】
1.利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于，将外源mva途径的全部基因插入大肠杆菌mg1655中，构建ptrc-cyp97-cprⅰ-dpp1载体，将重组载体转化至大肠杆菌mg1655中，改造后的工程菌以葡萄糖为底物，从头合成谱劳诺托。
2.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于：所述步骤s1中外源mva途径的全部基因包含erg10、erg13、hmg1、erg12、erg8、mvd1、idi1和erg20。
4.根据权利要求2所述的利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其特征在于：所述步骤s2中基因dpp1来源于酿酒酵母s288c，基因cyp97和基因cprⅰ分别来源于泰国巴豆的细胞色素p450单加氧酶cyp97c27和细胞色素p450还原酶cprⅰ。
5.根据权利要求2所述的利用大肠杆菌从头合成谱劳诺托的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：祁峰，黄子康，黄建忠，张媛，钟洁，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。