【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种cd44和lgr5作为标记物在筛选肿瘤干细胞中的应用。
技术介绍
1、胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，全球范围内每年新增胃癌患者大约 95万人，位居所有肿瘤类型的第四位；同时，每年胃癌患者死亡人数约为72万人，位居所有肿瘤类型的第二位。胃癌是一种严重威胁我国民众健康的重大疾病，同时带给整个社会的疾病负担在逐渐加重。随着当今社会经济迅猛发展，民众生活质量不断提高，对疾病认识不断深化，对生命健康的需求也逐日攀升。近十年，受益于医疗水平的提高和诊治手段的丰富，胃癌患者的总体预后有所改善，但是不可否认的是，胃癌在全球范围内总生存率依然徘徊在较低水平。这主要可以从疾病诊断时机和治疗效果两个方面分析：一、由于胃癌早期发现率很低，大多数胃癌患者在确诊时已经处于进展期或者晚期，肿瘤多伴有局部浸润和淋巴结转移，错过最佳治疗时间窗口；二、胃癌存在异质性差异，单一的治疗方式或者单独的某种药物无法达到治愈胃癌的目的。所以，现阶段胃癌的治疗策略是以多学科协同合作为框架的综合治疗模式，即是：联合外科手术和化疗（新）辅助治疗，根据患者病情需要可个体化追加进行靶向治疗或免疫治疗。然而，现实情况下特异性强、针对性好的化疗和靶向药物贫乏是限制胃癌治疗的瓶颈问题。
2、 “肿瘤干细胞”学说理论体系的丰富和完善，不断增进研究者们对肿瘤的深刻认知。肿瘤干细胞被认为是“具有持续自我更新能力，并且能够分化差异性肿瘤细胞的一小部分细胞”。这一类的细胞的特性可简称为肿瘤干细胞的“干性”。其中胃癌肿瘤干细胞（gastric
3、因此，为了提高胃癌临床疗效，亟需进一步探究胃癌肿瘤的起源和胃癌干细胞在肿瘤的发生发展中的作用，并探讨影响gcscs干细胞特性的有效机制，发掘其中的关键靶点并进行有效的靶向干预。
技术实现思路
1、针对以上问题，本专利技术目的之一在于提供一种cd44和lgr5作为标记物在筛选胃癌肿瘤干细胞中的应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术可以采用以下技术方案：
3、本专利技术一方面提供一种cd44和lgr5作为标记物在筛选胃癌肿瘤干细胞中的应用。
4、进一步地，上述应用中的筛选包括使用流式分选方法进行筛选，其中，anti-humanlgr5 mab（biolenged）作为lgr5的流式分选特异性抗体，apc-conjugated mouse anti-human cd44 mab（biolenged）作为cd44的流式分选特异性抗体。
5、进一步地，上述应用包括从原代胃癌组织细胞中筛选胃癌肿瘤干细胞。
6、进一步地，上述应用包括从肠型胃癌细胞系hgc-27中筛选胃癌肿瘤干细胞。
7、本专利技术另一方面提供一种cd44和lgr5作为标记物筛选的胃癌肿瘤干细胞作为靶点在制备治疗胃癌的药物中的应用。
8、进一步地，上述应用包括cd44和lgr5作为标记物筛选的胃癌肿瘤干细胞作为靶点在制备低耐性的治疗胃癌的药物中的应用。
9、进一步地，上述应用包括cd44和lgr5作为标记物筛选的胃癌肿瘤干细胞作为靶点在制备降低ki67和cyclin d1蛋白的表达的药物中的应用。
10、本专利技术有益效果至少包括：
11、（1）本专利技术成功通过流式分选技术从原代胃癌细胞和胃癌细胞系hgc-27分选出了cd44+lgr5+双阳性标记与cd44+lgr5-单阳性标记两组亚群胃癌干细胞，并且两组亚群细胞生长状态良好，并且具有良好的纯度，证明了流式分选技术是分选富集胃癌干细胞的可行性方法。
12、（2）本专利技术通过细胞增殖实验、悬浮球形成实验等检测，证实cd44+lgr5+双阳性亚群胃癌干细胞比cd44+lgr5-单阳性亚群具有更强的增殖能力和悬浮成球能力，反映了cd44+lgr5+双阳性标记胃癌干细胞亚群具有更好的自我更新能力的“干性”特点。
13、（3）本专利技术确定了cd44+lgr5+双阳性亚群胃癌干细胞比cd44+lgr5-单阳性亚群在蛋白水平和mrna水平的oct4、sox2、nanog关键干性转录因子高表达现象，进一步明确了cd44+lgr5+双阳性标记胃癌干细胞亚群具备更强的干细胞转录活性。
14、（4）本专利技术使用不同浓度的奥沙利铂、紫杉醇、氟尿嘧啶等临床常用胃癌化疗药物，对cd44+lgr5+双阳性和cd44+lgr5-单阳性亚群胃癌干细胞进行耐药干预实验，结果表明cd44+lgr5+双阳性亚群细胞比cd44+lgr5-单阳性亚群细胞具有更强的耐药性，降低其lgr5蛋白表达含量后耐药能力也随之变弱，说明了lgr5+标记的胃癌干细胞是抗肿瘤治疗出现抵抗或者耐药的可能原因之一。
15、（5）本专利技术中，不同标记亚群胃癌干细胞在在悬浮和贴壁不同培养环境下，emt调控因子在蛋白水平和mrna水平表达出现差异性变化，以确定性的结果表明了分选后的亚群胃癌干细胞具有上皮-间质转化能力，lgr5+标记的胃癌干细胞是能够促进加强该转化过程。
16、（6）本专利技术通过肿瘤细胞体内移植实验、transwell实验，发现cd44+lgr5+双阳性标记亚群干细胞在裸鼠体内成瘤的速度更快、增殖相关蛋白ki67和cyclin d1表达上调、穿孔透过小室的细胞数目增多，由此说明cd44+lgr5+双阳性亚群细胞具有更强的体内成瘤能力、增殖能力和迁移侵袭能力。
17、（7）本专利技术中经过试验得知，cd44+lgr5-单阳性标记亚群和cd44+lgr5+细胞双阳性标记亚群的分选纯度均大于90%，证明两种分选抗体具有极好的分选准确性，而且不同标记亚群细胞继续培养状态良好，分选过程对细胞损伤小，具有良好的细胞完整性，为后续实验研究提供了可行性基础。
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1.CD44和Lgr5作为标记物在筛选胃癌肿瘤干细胞中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，筛选包括使用流式分选方法进行筛选，其中，anti-human Lgr5 mAb，Biolenged作为Lgr5的流式分选特异性抗体，APC-conjugatedmouse anti-human CD44 mAb，Biolenged作为CD44的流式分选特异性抗体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括从原代胃癌组织细胞中筛选胃癌肿瘤干细胞。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括从肠型胃癌细胞系HGC-27中筛选胃癌肿瘤干细胞。
5.CD44和Lgr5作为标记物筛选的胃癌肿瘤干细胞作为靶点在制备治疗胃癌的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，应用包括：CD44和Lgr5作为标记物筛选的胃癌肿瘤干细胞作为靶点在制备低耐性的治疗胃癌的药物中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，应用包括：CD44和Lgr5作为标记物筛选的胃癌肿瘤干细胞作为靶点在制备降低Ki6
...【技术特征摘要】
1.cd44和lgr5作为标记物在筛选胃癌肿瘤干细胞中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，筛选包括使用流式分选方法进行筛选，其中，anti-human lgr5 mab，biolenged作为lgr5的流式分选特异性抗体，apc-conjugatedmouse anti-human cd44 mab，biolenged作为cd44的流式分选特异性抗体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括从原代胃癌组织细胞中筛选胃癌肿瘤干细胞。
4.根据权利要求1所述的应...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈志达，郗洪庆，张鹏飞，高云鹤，刘怡，张淦，卢婷婷，张海亚，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第一医学中心，
类型：发明
国别省市：
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