【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于纳米复合材料cmk-3@aunps及原子转移自由基聚(atrp)信号放大策略的新型桥本甲状腺炎标志物dr1电化学检测试剂盒及使用方法和应用，属于生物分析。
技术介绍
1、桥本甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis，ht)，也称慢性淋巴细胞性或自身免疫性甲状腺炎，是目前最常见的自身免疫性甲状腺疾病。ht合并甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势，ht患者的癌变率是非桥本氏甲状腺炎患者的1.68倍。转录下调因子1(down-regulator of transcription 1，dr1)是与ht密切相关的疾病标志物。因此，dr1的高灵敏检测对于ht的早期筛查、监测疾病进展以及提高治疗效果等方面具有重要意义。
2、目前，常见疾病标志物的检测方法有：免疫细胞化学法、酶联免疫吸附法、电化学传感法等。在这些方法中，电化学传感法因其特异性强、响应速度快、成本相对较低、便携性好等的优点，已广泛应用于靶分子的快速检测、临床诊断和分子医学等领域。但是基于1：1靶信号识别的电化学方法限制了传感器的广泛适用性，因此为了弥补缺陷，进一步提高电化学传感器的灵敏度和准确性，各种信号放大策略被用来提高电化学传感器的检测灵敏度。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于纳米复合材料cmk-3@aunps及原子转移自由基聚(atrp)信号放大策略的新型桥本甲状腺炎标志物dr1电化学检测试剂盒及使用方法和应用。
2、为了实现上述目的，
3、进一步，所述的桥本甲状腺炎标志物dr1电化学检测试剂盒还包括pbs缓冲液、liclo4。
4、进一步，使用时需将部分原料调配成不同浓度的溶液，其中，ab1、ab2溶液的浓度为1μg/ml，bsa溶液的质量浓度为1％，edc/nhs混合溶液中edc的浓度为20mm，nhs的浓度为5mm，bmp溶液的浓度为1mm，cubr2/me6tren溶液中cubr2的浓度为10mm，me6tren的浓度为10mm，fmma的浓度为10mm，aa的溶液浓度为2mm。
5、进一步，cmk-3@aunps纳米复合材料的制备方法为：
6、(1)将50ml1mm haucl4溶液，加热至沸腾；
7、(2)在步骤(1)所得溶液中加入10ml 38.8mm柠檬酸三钠溶液，继续保持沸腾状态直至溶液颜色不再变化；
8、(3)冷却至室温，得到aunps混悬液；
9、(4)将4.8mg cmk-3加入到4ml质量分数2％醋酸溶液中，并在冰水浴中超声处理2h，直至获得均匀分散的混悬液；
10、(5)将步骤(3)混悬液和步骤(4)混悬液等体积混合，并将混合体系继续超声处理1h，获得均匀分散的cmk-3@aunps纳米复合材料混悬液。
11、本专利技术的技术方案之一是提供一种所述桥本甲状腺炎标志物dr1检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
12、(1)将cmk-3@aunps纳米复合材料混悬液滴加于gce电极表面，孵育反应；
13、(2)将ab1溶液滴加在步骤(1)所得电极表面，孵育反应；
14、(3)将步骤(2)所得电极浸泡在bsa溶液中，孵育反应；
15、(4)将待检测样品溶液滴加于步骤(3)所得电极表面，孵育反应；
16、(5)将ab2溶液滴加于步骤(4)所得电极表面，孵育反应；
17、(6)将步骤(5)所得电极浸泡在活化后的bmp溶液中，孵育反应；
18、(7)将步骤(6)所得电极浸泡在由cubr2/me6tren溶液、fmma溶液、aa溶液和pbs缓冲液组成的混合溶液中，孵育反应；
19、(8)电化学检测
20、①将步骤(7)所得电极以超纯水洗涤，而后用氮气吹干；
21、②将步骤①的电极浸入liclo4溶液中，用swv检测电化学信号响应，扫描范围为0～0.8v。
22、进一步，gce电极先进行预处理：以0.3μm的氧化铝粉末对gce电极进行机械抛光，得到光滑平整的电极表面；然后，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水进行超声清洗，并在氮气流中干燥。
23、进一步，步骤(6)中bmp溶液的活化方法为：将bmp溶液和edc/nhs混合溶液等体积混合，在37℃摇床中活化过夜。
24、进一步，步骤(1)中的反应温度为36-38℃，反应时间为10-30min；步骤(2)中反应条件为：36-38℃反应过夜；步骤(3)-(7)中的反应温度为36-38℃，反应时间为0.5 -1h。
25、本专利技术的技术方案之一是提供一种所述桥本甲状腺炎标志物dr1检测试剂盒在检测桥本甲状腺炎标志物dr1中的应用。
26、基于cmk-3@aunps及atrp信号放大策略的新型dr1电化学检测试剂盒构建流程如图1a所示。首先cmk-3@aunps纳米复合材料在gce表面形成稳定而致密的电子传导活性层。然后，ab1通过金氨键连接在电极表面，随后bsa封闭电极表面未结合的非特异性位点。ab1和ab2通过抗原-抗体特异性识别捕获dr1，在电极表面形成一个三明治夹心结构。接着，引发剂bmp的羧基被edc/nhs活化为琥珀酰亚胺酯结构(abmp)。随后abmp通过酰胺键修饰在电极表面引发atrp反应，使大量fmma单体在电极表面聚合接枝，从而显著增强电化学信号的输出。
27、atrp的反应机理如图1b所示。以有机卤代物r-x作为引发剂，活性种cu(i)/me6tren进攻r-x中的卤素原子生成初级自由基r·和cu(ii)/me6tre-x高氧化态络合物休眠种。还原剂(aa)可以继续将x-cu(ii)/me6tre-x还原成具有催化活性的活性种cu(i)/me6tren，催化r·与单体进行双键加成，从而引发聚合反应，形成rn·聚合物链接枝。
28、本专利技术的有益效果：
29、1、该试剂盒基于cmk-3@aunps及atrp聚合信号放大策略显著提高了检测灵敏度，同时具有良好的抗干扰性、选择性、稳定性和重现性。
30、2、该试剂盒具有高效、操作方便、灵敏度高的优点，且在正常人血清中的检测性能良好，有可靠的实际应用价值。
31、3、在最佳实验条件下，研究了该试剂盒在一定的dr1浓度范围内的分析性能。用不同浓度的dr1检测传感体系的电化学信号强度，发现在5×10-4ng/ml～5×102ng/ml的浓度范围内，峰值电流与dr1浓度的对数呈现良好的线性关系，线性回归方程为i(μa)＝0.99847×lg(cdr1)+0.817本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于CMK-3@AuNPs及ATRP信号放大策略的新型桥本甲状腺炎标志物DR1电化学检测试剂盒，其特征在于，包括以下原料：GCE电极、CMK-3@AuNPs纳米复合材料、Ab1、BSA、Ab2、BMP、EDC、NHS、CuBr2、Me6TREN、FMMA、AA。
2.根据权利要求1所述的桥本甲状腺炎标志物DR1电化学检测试剂盒，其特征在于，还包括PBS缓冲液、LiClO4。
3.根据权利要求1所述的桥本甲状腺炎标志物DR1检测试剂盒，其特征在于，使用时需将部分原料调配成不同浓度的溶液，其中，Ab1、Ab2溶液的浓度为1μg/mL，BSA溶液的质量浓度为1％，EDC/NHS混合溶液中EDC的浓度为20mM，NHS的浓度为5mM，BMP溶液的浓度为1mM，CuBr2/Me6TREN溶液中CuBr2的浓度为10mM，Me6TREN的浓度为10mM，FMMA的浓度为10mM，AA的溶液浓度为2mM。
4.根据权利要求1所述的桥本甲状腺炎标志物DR1检测试剂盒，其特征在于，CMK-3@AuNPs纳米复合材料的制备方法为：
5.一种如权利要
6.根据权利要求5所述桥本甲状腺炎标志物DR1检测试剂盒的使用方法，其特征在于，GCE电极先进行预处理：以0.3μm的氧化铝粉末对GCE电极进行机械抛光，得到光滑平整的电极表面；然后，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水进行超声清洗，并在氮气流中干燥。
7.根据权利要求5所述桥本甲状腺炎标志物DR1检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(6)中BMP溶液的活化方法为：将BMP溶液和EDC/NHS混合溶液等体积混合，在37℃摇床中活化过夜。
8.根据权利要求5所述桥本甲状腺炎标志物DR1检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)中的反应温度为36-38℃，反应时间为10-30min；步骤(2)中反应条件为：36-38℃反应过夜；步骤(3)-(7)中的反应温度为36-38℃，反应时间为0.5-1h。
9.一种如权利要求1-4任一项所述桥本甲状腺炎标志物DR1检测试剂盒在检测桥本甲状腺炎标志物DR1中的应用。
...【技术特征摘要】
1.基于cmk-3@aunps及atrp信号放大策略的新型桥本甲状腺炎标志物dr1电化学检测试剂盒，其特征在于，包括以下原料：gce电极、cmk-3@aunps纳米复合材料、ab1、bsa、ab2、bmp、edc、nhs、cubr2、me6tren、fmma、aa。
2.根据权利要求1所述的桥本甲状腺炎标志物dr1电化学检测试剂盒，其特征在于，还包括pbs缓冲液、liclo4。
3.根据权利要求1所述的桥本甲状腺炎标志物dr1检测试剂盒，其特征在于，使用时需将部分原料调配成不同浓度的溶液，其中，ab1、ab2溶液的浓度为1μg/ml，bsa溶液的质量浓度为1％，edc/nhs混合溶液中edc的浓度为20mm，nhs的浓度为5mm，bmp溶液的浓度为1mm，cubr2/me6tren溶液中cubr2的浓度为10mm，me6tren的浓度为10mm，fmma的浓度为10mm，aa的溶液浓度为2mm。
4.根据权利要求1所述的桥本甲状腺炎标志物dr1检测试剂盒，其特征在于，cmk-3@aunps纳米复合材料的制备方法为：
...【专利技术属性】
技术研发人员：张亚萍，崔晓静，李一帆，杨怀霞，刘艳菊，司富春，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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