【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、schizochytrium sp.是一种海洋真菌，能合成多种有益活性物质，如脂肪酸、角鲨烯、色素(叶黄素、虾青素、类胡萝卜素)等。其含油量可达干真菌细胞的50％以上，多不饱和脂肪酸(pufas)在总脂质中所占比例可达40％～70％。
2、pufas主要通过聚酮合成酶的厌氧途径产生，以游离脂肪酸的形式释放并积聚在磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰甘油(pg)或磷脂酰肌醇(pi)等极性磷脂中，最终迁移至二酰基甘油(dag)或三酰基甘油(tag)等非极性脂质中储存。
3、相关技术中，对裂殖壶菌产多不饱和脂肪酸(pufas)的调控主要集中于在发酵过程中利用调节剂进行调控，其调控的方式较为局限。
4、目前，对磷酸胆碱胞苷转移酶(cct)的研究比较有限，主要集中在动物器官和昆虫方面，在裂殖壶菌的基因工程领域的研究尚未见报道。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，提供一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌及其构建方法和应用。本专利技术以裂殖壶菌schizochytrium limacinum sr21为原始菌株，通过对其磷脂代谢通路进行改造，促进油脂合成和多不饱和脂肪酸的积累。
2、为此，在本专利技术的实施例中，本专利技术在第一方面提出了一种过表达磷酸胆
3、根据本专利技术的实施例的，该工程菌中的磷脂含量大幅度提高。在裂殖壶菌中，pufas会先与磷脂结合，然后在pdat、pdct及dgat等酶的作用下转移至dag和tag。因此，通过过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因cct以提高磷脂代谢，显著促进了油脂的合成和pufas的积累，在保持细胞干重不变的情况下，油脂含量增加了20％，pufas含量增加了15％。
4、本专利技术在第二方面提出了上述基因工程菌的构建方法，其包括以下步骤：
5、(1)以s.limacinum sr21基因组dna为模板，seq id no：2和seq id no：3所示的序列为引物，pcr扩增出磷酸胆碱胞苷转移酶基因cct；
6、(2)将所述磷酸胆碱胞苷转移酶基因cct插入pblue-zeo-18sud过表达载体的同源重组区域，构建以博来霉素为抗性的cct过表达载体pblue-zeo-18sud-cct；
7、(3)将所述过表达载体pblue-zeo-18sud-cct的同源重组区域线性化，电转化至s.limacinum sr21的基因组中进行同源重组，通过博来霉素抗性筛选和鉴定，获得过表达cct基因的基因工程菌sr21::cct。
8、根据本专利技术的实施例，该方法基于基因工程手段在大肠杆菌中构建磷脂通路关键步骤——磷酸胆碱胞苷转移酶(cct)基因过表达载体，然后将带有博来霉素抗性筛选基因的表达框插入到sr21基因组的18sdna位点构建裂殖壶菌工程菌，工程菌的总油脂和磷脂含量均显著增加，多不饱和脂肪酸积累增加，为调控裂殖壶菌提高脂肪酸合成提供了理论依据。
9、在本专利技术的第二方面提出了上述过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌在生产脂肪酸中的应用。
10、在本专利技术的第三方面中提出了一种强化裂殖壶菌磷脂代谢提高脂肪酸生成的方法，其将上述的过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌接种于种子培养基活化后，获得发酵用菌种；将所述发酵菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集菌体进行油脂组分鉴定分析。
11、可选地，将所述过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌在固体种子培养基上划线，在27～29℃条件下静置培养；挑取平板上的单克隆至液体种子培养基，在27～29℃，200～250rpm条件下培养，获得一级种子；将所述一级种子以4％～8％的接种量接种至新的液体种子培养基，在27～29℃，200～250rpm条件下培养，获得二级种子；将二级种子以4％～8％的接种量接种至发酵培养基，在27～29℃，200～250rpm条件下培养120h，培养过程中每隔24h取样进行相关分析。
12、本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在出发菌中过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因CCT得到；所述出发菌为裂殖壶菌S.
2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求1所述的过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌在生产脂肪酸中的应用。
4.一种强化裂殖壶菌磷脂代谢提高脂肪酸生成的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌接种于种子培养基活化后，获得发酵用菌种；将所述发酵菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集菌体进行油脂组分鉴定分析。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌在固体种子培养基上划线，在27～29℃条件下静置培养；挑取平板上的单克隆至液体种子培养基，在27～29℃，200～250rpm条件下培养，获得一级种子；将所述一级种子以4％～8％的接种量接种至新的液体种子培养基，在27～29℃，200～250rpm条件下培养，获得二级种子；将二级种子以4％～8％的接种量接种至
...【技术特征摘要】
1.一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在出发菌中过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因cct得到；所述出发菌为裂殖壶菌s.
2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求1所述的过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌在生产脂肪酸中的应用。
4.一种强化裂殖壶菌磷脂代谢提高脂肪酸生成的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的过表达磷酸胆碱胞苷转移酶基因的基因工程菌接种于种子培养基活化后，获得发酵用菌种；将所述发酵菌种接种于发酵培养基中进行发酵培...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。