【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，尤其涉及一种盐单胞菌j9u及其衍生菌的构建方法、pha制备方法与应用。
技术介绍
1、工业生物技术是指通过微生物发酵或无细胞生物催化，在温和的条件下将原材料转化为所需的化学物质、材料和能源的技术，它可以有效缓解环境污染问题，实现可持续发展。但现有工业生物技术存在许多缺点：易发生微生物污染，对生物反应器、操作人员、发酵条件和发酵程序要求十分严格，微生物生长缓慢，原材料价格昂贵，底物到产物的转化率低，生产过程难以连续，产品分离纯化困难，消耗大量淡水和能源等。这些缺点导致工业生物技术生产成本较高，无法与以低廉的石油为基础的传统化学工业竞争。下一代工业生物技术，是一种低成本生物加工技术，其核心是利用生长在特殊环境中的极端微生物，盐单胞菌(halomonas spp.)在高盐和碱性环境中能够快速生长，这为限制杂菌生长提供了双重保证。以盐单胞菌为基础开发的下一代工业生物技术可以有效节约淡水和能源、降低发酵过程的复杂性和生产成本。
2、聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，pha)是一类在微生物体内广泛存在且呈颗粒状的高分子生物材料。pha是由不同r型羟基脂肪酸单体通过酯键聚合而成的聚酯，但都含有相同的结构通式，依据单体的侧链组成可以分为两类：若单体是由3～5个碳原子组成的称为短链pha，若单体是由6～14个碳原子以上组成的称为长链pha，还有一些是由中长链和短链共同组成的混合类型pha，如聚羟基丁酸羟基乙酸酯，及3hb和其他超过6个碳原子的3-羟基脂肪酸组成的共聚物。其中均聚物3-羟基
3、目前，研究人员已开发了适用于盐单胞菌的多种基因编辑工具和调控元件，以快速获得优良的目标性状。盐单胞菌halomonas bluephagenesis是清华大学陈国强团队从新疆艾丁湖中分离出来的，该菌株可在不灭菌条件下，在海水中生长数周至数月不被污染。h.bluephagenesis td01是以葡萄糖为主要碳源生产pha和其他高价值化合物的下一代工业生物技术开发的理想底盘生物。fu等建立了质粒接合转化到嗜盐菌中的方法，并利用自杀载体pre1126i-scei建立了无标记的基因敲除技术。这是一种兼具同源重组与位点特异性重组特点的重组系统—ⅰ-sceⅰ基因敲除系统。ⅰ-sceⅰ是在s.cerevisiae中发现的一种非固定内含子编码的核酸内切酶。同flp/frt和cre/loxp一样，这种酶也能识别一个大小为18bp的特异性识别位点，但与上述二者不同的是，该种内切酶发挥作用时，会引起识别位点处的dna分子双链断裂，从而诱导菌株基因组自身的sos应急修复系统，实现基因的无痕敲除。但目前该方法耗时长且效率低，无法敲除基因组大片段，限制了它的应用范围，迫切需要一种高效的基因编辑方法。
4、寻找廉价碳源作为pha发酵的底物能够有效降低phas的生产成本，提高phas的市场竞争力，同时能实现一些废弃资源的回收再利用从而解决一系列环境污染问题，如木质纤维素。目前，木质纤维素作为地球上最丰富以及最便宜的可再生生物质资源，其广泛存在于林木、农业废弃物如小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆等，能够有效利用这些废弃生物质资源转化生产高附加值化学品phas，可以大大降低phas的底物生产成本。通常木质纤维素包括40～50％的纤维素、20～50％的半纤维素和20～30％的木质素，以木质纤维素作为底物之前需要首先将其用酸或碱进行预处理，破坏木质纤维素的结构后再通过纤维素酶和半纤维素酶酶解的方式获得木质纤维素水解液，最后微生物便能够利用这些发酵糖生产phas。
5、木质纤维素水解后的产物除葡萄糖外，木糖是木质纤维素水解物中最丰富的戊糖，纤维二糖同样也是木质纤维素水解物中丰富的二糖，能够同时有效利用葡萄糖、木糖或纤维二糖生产pha，对于木质纤维素水解液发酵生产是至关重要的。目前，tan等人利用盐单胞菌h.bluephagenesis进行木糖代谢途径改造，由于其不能天然利用木糖，首先引入了四种不同的木糖特异性转运蛋白，但木糖只能转运而不被消耗，来自大肠杆菌的木糖异构酶xyla的进一步表达使细胞能够利用木糖积累0.39g/l的聚-3-羟基丁酸酯(phb)，木酮糖激酶的额外过表达以将碳通量引导到磷酸戊糖途径中降低了phb的产生。随后又通过引入d-塔格糖-3-差向异构酶、岩藻激酶和岩藻糖磷酸醛缩酶来构建核酮糖-1-磷酸途径，重组菌株的phb产量为0.87g/l，细胞干重达到2.09g/l。最后，通过过量表达外源性磷酸酮酶引入了另一种碳高效磷酸酮酶途径，该途径将细胞干重和phb滴度分别提高到1.88g/l和1.2g/l，这是第一篇关于h.bluephagenesis利用木糖的报道，将为利用木糖生产工业聚羟基烷酸酯提供有益的工程策略，但该改造过后细胞干重仍然较低，且在10g/l葡萄糖和10g/l木糖的混合糖发酵培养基中，葡萄糖的存在会抑制木糖的利用，因此在木质纤维素水解液发酵方面仍然受到极大的限制。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种盐单胞菌j9u及其衍生菌的构建方法、pha制备方法与应用，所述盐单胞菌j9u衍生菌能够利用木糖生产聚羟基脂肪酸酯，且得到的聚羟基脂肪酸酯产量高。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种盐单胞菌j9u的构建方法，包括以下步骤：
4、酶切自杀质粒pk18mobsacb，得到线性化质粒pk18mobsacb；
5、将upp基因的上下游同源臂序列与线性化质粒pk18mobsacb连接，得到打靶载体pk18δupp；
6、将含有打靶载体pk18δupp的宿主细胞转入渴望盐单胞菌j9中，得到重组菌，重组菌经过两次同源重组，得到盐单胞菌j9u。
7、优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌e.coli s17-1λpir；
8、所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述重组菌进行第一次同源重组，得到双层条带的菌株，然后将双层条带的菌株进行第二次同源重组；所述单交换菌株的筛选的方式包括重组菌培养在含有硫酸卡那霉素抗性的高盐培养基中；所述双交换菌株的筛选的方式包括将双层条带的菌株培养在含有5-氟尿嘧啶的高盐培养基中；
9、所述高盐培养基包括60lb培养基，所述60lb培养基的配制方法：25.0g/l lb mix和60.0g/lnacl混合即得；所述硫酸卡那霉素的浓度为100μg/ml以上；所述5-氟尿嘧啶的浓度为100μg/ml以上。
10、本专利技术还提供了一种盐单胞菌j9u衍生菌，所述盐单胞菌j9u衍生菌基因组中的xyld基因失活，所述盐单胞菌j9u衍生菌包括xyla基因；所述盐单胞菌j9u衍生菌出发菌株为上述构建方法得到的盐单胞菌j9u。
11、优选的，所述xyld基因的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述xyla基因的核苷酸序列如seq id no.33所示；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种盐单胞菌J9U的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coliS17-1λpir；
3.一种盐单胞菌J9U衍生菌，其特征在于，所述盐单胞菌J9U衍生菌基因组中的xylD基因失活，所述盐单胞菌J9U衍生菌包括xylA基因；所述盐单胞菌J9U衍生菌出发菌株为权利要求1或2所述构建方法得到的盐单胞菌J9U。
4.根据权利要求3所述的盐单胞菌J9U衍生菌，其特征在于，所述xylD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，所述xylA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；在所述xylA基因上游插入上调xylA基因的启动子，所述启动子为P8启动子，所述P8启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。
5.一种权利要求3或4所述盐单胞菌J9U衍生菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述重组菌J9U或含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述upp基因为含有启动子的upp基因，所述含有启动子的upp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；所述P8xylA的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示。
8.根据权利要求5～7任意一项构建方法所述的盐单胞菌J9U衍生菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。
9.一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，将权利要求5～7任意一项构建方法所述的盐单胞菌J9U衍生菌在含有木糖的发酵培养基中培养，得到聚羟基脂肪酸酯。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括葡萄糖；优选的，所述发酵培养基还包括NH4Cl；优选的所述发酵培养基还包括葡萄糖和NH4Cl；
...【技术特征摘要】
1.一种盐单胞菌j9u的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌e.colis17-1λpir；
3.一种盐单胞菌j9u衍生菌，其特征在于，所述盐单胞菌j9u衍生菌基因组中的xyld基因失活，所述盐单胞菌j9u衍生菌包括xyla基因；所述盐单胞菌j9u衍生菌出发菌株为权利要求1或2所述构建方法得到的盐单胞菌j9u。
4.根据权利要求3所述的盐单胞菌j9u衍生菌，其特征在于，所述xyld基因的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述xyla基因的核苷酸序列如seq id no.33所示；在所述xyla基因上游插入上调xyla基因的启动子，所述启动子为p8启动子，所述p8启动子的核苷酸序列如seq id no.32所示。
5.一种权利要求3或4所述盐单胞菌j9u衍生菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述重组菌j9u或含有打靶载体pkju-p8xyla的重组菌j9u...
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