【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米制剂，具体涉及一种三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒及其制备方法和应用。
技术介绍
1、胶质母细胞瘤(gbm)是原发于中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。目前gbm的临床治疗包括手术切除，放疗以及化疗。然而gbm细胞具有高度放射抗性并呈弥漫性生长，易侵入周围脑组织，导致患者的中位总生存期短、肿瘤复发率高。故迫切需要新的治疗方法来提高患者的长期生存率。免疫治疗，其通过刺激肿瘤细胞释放损伤相关分子模式(damp)，进而诱导免疫原性细胞死亡(icd)，促进抗癌免疫消除癌细胞并诱导免疫记忆以防止复发。而免疫治疗目前也面临着困境：临床治疗过程中，不同患者对免疫疗法的响应程度不同。并且由于肿瘤细胞特殊的代谢方式，造成了免疫抑制的肿瘤微环境，肿瘤组织内浸润的免疫杀伤细胞比例较低，导致免疫疗法的治疗效果欠佳。因此，多模型联合免疫治疗克服脑胶质瘤的治疗困境极为重要。在此，提出了光动力治疗/化疗/免疫治疗三模式协同治疗脑胶质瘤方案，诱导肿瘤细胞发生凋亡、免疫原性死亡以及铁死亡。
2、中药砒霜——三氧化二砷(ato)作为已获得中国食品药品监督管理总局正式批准用于治疗肿瘤的药物，已被证明能够下调肿瘤干细胞表达干性的标志物cd133蛋白的表达，诱导终末分化并控制肿瘤的恶性潜能。铁死亡(ferroptosis)作为新型细胞程序性死亡方式，其显著特点是细胞内脂质活性氧生成与降解平衡失调。铁死亡发生依赖于脂质过氧化物(lpos)和不稳定铁池(lip)过度积累，以及谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)失活。此外，溶质载体家族7号成员11
3、从免疫学角度看，gbm受肿瘤免疫微环境(tme)的高抑制性、低免疫原性和t细胞浸润不足的限制。因此，gbm的免疫治疗除了通过促进tam的极化来重塑tme外，还需要增强肿瘤细胞的免疫原性。肿瘤的免疫原性细胞死亡(icd)已被证明是提高肿瘤细胞免疫原性的有效手段。垂死的肿瘤细胞释放肿瘤相关抗原(taa)和损伤相关分子模式(damps)，然后激活适应性免疫反应，激发细胞毒性t淋巴细胞(ctl)介导的抗肿瘤作用，并引发持久的免疫记忆。基于光敏剂的光动力疗法(pdt)能够引起活性氧(ros)的产生从而引发icd效应，且pdt能够损伤与肿瘤相关的脉管系统,致使肿瘤缺血性死亡。ir780作为一种七甲胺菁染料，具有优异的近红外(nir)吸收、深层组织渗透和低生物毒性特点，其可在808nm nir照射下活化，用于肿瘤治疗，并且ir780被证实能高效聚集于肿瘤细胞线粒体，通过靶向线粒体大大提高pdt的效果。此外，它也可以作为荧光成像肿瘤的探针，以准确诊断。然而，近红外激光的穿透深度有限，以及肿瘤的多种防御机制，单靠pdt只能发挥有限的免疫治疗作用。
4、此外，由于血液系统与脑组织之间存在的天然屏障系统-血脑屏障(bbb)，其能够将98％的小分子和近乎100％的大分子药物排除在外。来源于原代胶质瘤细胞的外泌体可以促进内皮细胞中stat3磷酸化，进而通过激活jak-stat3信号通路提高lcn2蛋白表达增强内皮细胞的膜流动性，促进药物穿透bbb。虽然外泌体显示出穿透血脑屏障的能力，但许多研究者认为静脉注射的外泌体主要分布在肝脏或脾脏，只有很小一部分保留在大脑或肿瘤部位。
技术实现思路
1、专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术目的是提供一种三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒及其制备方法和应用，本专利技术将亲水性和疏水性药物活性成分依次进行纳米化处理，以w1/o/w2形式装载形成内核，利用w1/o/w2内部较大的容量有效负载亲水性药物，如ato，并且通过外层水相结构有效地保留内部装载的生物活性成分，起到缓释与保护药物防降解作用。本专利技术利用同源重组外泌体，去除内部活性物质减轻毒性，并且保留空腔结构利于高效载药。同时对天然外泌体进行表面修饰，发挥其同源归巢与磁靶向的作用，实现光动力治疗/化疗/免疫治疗三模式协同治疗脑胶质瘤。。
2、技术方案：为了达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，所述仿生纳米粒主要是由脑胶质瘤细胞来源的重组外泌体负载w1/o/w2型复乳内核，进一步经磁性材料修饰所形成；所述w1/o/w2型复乳内核是由聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸作为油相，与亲水性化疗药物和亲脂性光敏剂所形成的复乳。
4、所述脑胶质瘤细胞来源的重组外泌体作为载体外壳，在保留其特征膜蛋白的同时去除了内部多余蛋白质、dna及rna，保留其同源归巢性，共孵育包覆药物内核。并通过酰胺反应将磁性材料偶联到外泌体表面，实现制剂的体内磁靶向性。
5、优选的，所述脑胶质瘤细胞选自gl261脑胶质瘤细胞；所述磁性材料选自spion-cooh、spion-nh2或fe3o4@sio2。
6、优选的，所述脑胶质瘤细胞来源的重组外泌体，其制备方法包括：将脑胶质瘤细胞来源的外泌体依次进行超声破碎，孵育，离心，最后用缓冲液进行重悬，得到所述重组外泌体。
7、进一步优选的，所述脑胶质瘤细胞来源的外泌体采用梯度离心法、超速离心法相结合的方式提取得到；所述超声破碎的时间为5-10min，功率为250-350w，超声频率为1-2s/4-6s开/关；所述孵育的温度为37±3℃，孵育时间为50-70min；所述缓冲液采用磷酸缓冲液，ph为7.0-7.4。
8、优选的，所述亲水性化疗药物选自三氧化二砷(ato)、索拉非尼、柳氮磺胺吡啶或青蒿素；所述亲脂性光敏剂选自吲哚菁绿(icg)、华卟啉钠、ir820或ir780。
9、优选的，所述w1/o/w2型复乳内核的制备方法，包括以下步骤：
10、取亲水性化疗药物的水溶液，作为内水相(w1)，用溶有聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸的溶液溶解亲脂性光敏剂，作为油相(o)，使内水相慢慢滴到油相中，超声处理得到油包水初乳，即w1/o；在搅拌条件下，将w1/o乳液缓慢加入含有乳化剂的水溶液(w2)中，再超声处理形成w1/o/w2复乳，挥发油相，即得w1/o/w2型复乳内核。
11、进一步优选的，所述乳化剂为泊洛沙姆、聚乙烯醇或聚丙烯酸；当固体质量为mg时，液体质量以ml计，各原料的用量为：亲水性化疗药物1份，亲脂性光敏剂1～2份，聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸1～10份，乳化剂1～10份。。
12、本专利技术还提供了所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述仿生纳米粒主要是由脑胶质瘤细胞来源的重组外泌体负载W1/O/W2型复乳内核，进一步经磁性材料修饰所形成；所述W1/O/W2型复乳内核是由聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸作为油相，与亲水性化疗药物和亲脂性光敏剂所形成的复乳。
2.根据权利要求1所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述脑胶质瘤细胞选自GL261脑胶质瘤细胞；所述磁性材料选自SPION-COOH、SPION-NH2或Fe3O4@SiO2。
3.根据权利要求1所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述脑胶质瘤细胞来源的重组外泌体，其制备方法包括：将脑胶质瘤细胞来源的外泌体依次进行超声破碎，孵育，离心，最后用缓冲液进行重悬，得到所述重组外泌体。
4.根据权利要求3所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述脑胶质瘤细胞来源的外泌体采用梯度离心法、超速离心法相结合的方式提取得到；所述超声破碎的时间为5-10min，功率为250-350W，超声频率为1-2s/4-6s开
5.根据权利要求1所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述亲水性化疗药物选自三氧化二砷(ATO)、索拉非尼、柳氮磺胺吡啶或青蒿素；所述亲脂性光敏剂选自吲哚菁绿(ICG)、华卟啉钠、IR820或IR780。
6.根据权利要求1所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述W1/O/W2型复乳内核的制备方法，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述乳化剂为泊洛沙姆、聚乙烯醇或聚丙烯酸；当固体质量为mg时，液体质量以mL计，各原料的用量为：亲水性化疗药物1份，亲脂性光敏剂1～2份，聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸1～10份，乳化剂1～10份。
8.权利要求1-7任一项所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述重组外泌体与药物溶液中药物的质量比为(1-3):1，其中，重组外泌体的质量以其含有的蛋白的质量计，所述超声时间为5-10min，功率为250-350W，超声频率为1-2s/4-6s开/关；步骤(4)中，以质量计，所述共载多元复合物内核的纳米颗粒1份，所述磁性材料1-5份，搅拌时间为1-12h。
10.权利要求1-7任一项所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒在制备治疗脑胶质瘤药物或脑胶质瘤诊断试剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述仿生纳米粒主要是由脑胶质瘤细胞来源的重组外泌体负载w1/o/w2型复乳内核，进一步经磁性材料修饰所形成；所述w1/o/w2型复乳内核是由聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸作为油相，与亲水性化疗药物和亲脂性光敏剂所形成的复乳。
2.根据权利要求1所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述脑胶质瘤细胞选自gl261脑胶质瘤细胞；所述磁性材料选自spion-cooh、spion-nh2或fe3o4@sio2。
3.根据权利要求1所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述脑胶质瘤细胞来源的重组外泌体，其制备方法包括：将脑胶质瘤细胞来源的外泌体依次进行超声破碎，孵育，离心，最后用缓冲液进行重悬，得到所述重组外泌体。
4.根据权利要求3所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述脑胶质瘤细胞来源的外泌体采用梯度离心法、超速离心法相结合的方式提取得到；所述超声破碎的时间为5-10min，功率为250-350w，超声频率为1-2s/4-6s开/关；所述孵育的温度为37±3℃，孵育时间为50-70min；所述缓冲液采用磷酸缓冲液，ph为7.0-7.4。
5.根据权利要求1所述的三位一体协同治疗脑胶质瘤的同源仿生纳米粒，其特征在于，所述亲水性化疗药物选自三氧化...
【专利技术属性】
技术研发人员：王若宁，张瀚文，汤晨露，狄留庆，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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