【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及产l-2,3-二氨基丙酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用，属于发酵工程领域。
技术介绍
1、l-2,3-二氨基丙酸是一种非蛋白质氨基酸，许多植物及细菌都能合成该物质。l-2,3-二氨基丙酸是合成神经毒素三七素（β-n-草酰基-l-α,β-二氨基丙酸）的直接前体，该物质具有止血、抗炎、神经保护及减轻糖尿病肾病等药理活性。同时，l-2,3-二氨基丙酸也是多种抗生素合成的关键前体，如紫霉素和卷曲霉素。此外，l-2,3-二氨基丙酸对糖酵解及氨基酸合成中以磷酸吡哆醛为辅因子的酶有抑制作用，并且抑制一些菌株的生长。
2、目前l-2,3-二氨基丙酸主要依赖于化学合成，但是存在转化困难，需要易爆有毒化学品添加。中国专利技术专利申请cn114517174 a中公开了l-o-磷酸丝氨酸可以在2 ,3-二氨基丙酸生物合成酶 sbnab（通过表达金黄色葡萄球菌中负责铁载体合成和转运的基因簇）的作用下合成2 ,3-二氨基丙酸。然而现有的 sbnab在大肠杆菌中合成l-2,3-二氨基丙酸存在产量低，添加的抗生素和诱导剂影响工业生产等问题。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术旨在通过代谢工程手段改造大肠杆菌获得一株产l-2,3-二氨基丙酸的重组大肠杆菌及在l-2,3-二氨基丙酸生产中的应用。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、一株产l-2,3-二氨基丙酸的重组大肠杆菌，
4、为了进一步提高l-2,3-二氨基丙酸的产量，还在所述出发菌基因组中敲除与丝氨酸合成相关的基因。优选地，与丝氨酸合成相关的敲除基因为磷酸丝氨酸磷酸化酶编码基因 serb。
5、为了进一步提高l-2,3-二氨基丙酸的产量，在所述出发菌基因组中还再次利用所述ptrc启动子，同源过表达与l-2,3-二氨基丙酸代谢途径相关的基因。优选地，与l-2,3-二氨基丙酸代谢途径相关的同源基因为3-磷酸甘油酸脱氢酶编码基因 sera和磷酸丝氨酸转氨酶编码基因 serc。
6、本专利技术还提供一种上述重组大肠杆菌的构建方法，包括：向所述出发菌基因组中以所述ptrc启动子驱动插入所述基因簇 sbnab，并将所述基因簇 sbnab在大肠杆菌的染色体dna上进行多拷贝过表达。其中，多拷贝倍数可为1、2或3等。
7、上述重组大肠杆菌的构建方法还包括在所述发菌基因组中敲除与丝氨酸合成相关的基因的步骤；
8、上述重组大肠杆菌的构建方法还包括再次以所述ptrc启动子驱动所述出发菌基因组中与l-2,3-二氨基丙酸代谢途径相关的基因进行过表达处理的步骤。
9、本专利技术还提供了一种上述产l-2,3-二氨基丙酸的重组大肠杆菌在发酵生产l-2,3-二氨基丙酸中的应用。优选地，发酵过程中使用的培养基包括10～20 g/l 简单碳源、1～5 g/l酵母粉、6～8 g/l na2hpo4、0.3～1 g/l nacl、2～4 g/l kh2po4、1～5 g/l nh4cl、1～5 g/l (nh4)2so4、0.5～2 g/l谷氨酸钠。其中，所述简单碳源优选为葡萄糖、甘油或两者的结合。
10、具体地，将所述重组大肠杆菌按照体积分数1%～10%的接种量接种到所述培养基中，于34℃～37℃发酵生产l-2,3-二氨基丙酸。其中，所述发酵生产可以为摇瓶发酵生产，也可以为发酵罐发酵生产。
11、当采用摇瓶发酵生产时，将所述重组大肠杆菌按照1%～10%的接种量接种到摇瓶中，于34℃～37℃进行摇瓶发酵培养产l-2,3-二氨基丙酸的菌株；其中采用的培养基为摇瓶培养基，优选包括10～20 g/l 简单碳源、1～3 g/l酵母粉、6～8 g/l na2hpo4、0.3～1 g/l nacl、2～4 g/l kh2po4、1～5 g/l nh4cl、1～5 g/l (nh4)2so4、0.5～2 g/l谷氨酸钠、1～5 g/l mops（3-吗啉丙磺酸缓冲液）。
12、当采用发酵罐生产时，先将所述重组大肠杆菌接种至lb培养基中进行摇瓶放大培养，得到摇瓶种子液；再将所述摇瓶种子液以体积分数5%～10%接种量接种到发酵罐中，于34℃-37℃、溶氧维持在30%～50%的条件下发酵培养。优选地，所述培养基为发酵罐培养基，包括10～20 g/l简单碳源、2～5 g/l酵母粉、6～8 g/l na2hpo4、0.3～1 g/l nacl、2～4 g/l kh2po4、1～5 g/l nh4cl、1～5 g/l (nh4)2so4、0.5～2 g/l谷氨酸钠、0.1～1 g/l mgso4，0.1～1 g/l cacl2。
13、因此，本专利技术提供了一种利用代谢工程改造的生产l-2,3-二氨基丙酸的重组大肠杆菌菌株，该重组大肠杆菌与野生大肠杆菌菌株相比，能更好的利用简单碳源生产l-2,3-二氨基丙酸，所述重组大肠杆菌在摇瓶中能够高效积累三七素2.4 g/l，在3 l发酵罐产量达12.1 g/l，转化率达0.41 g/g。利用本专利技术提供的重组大肠杆菌菌株生产l-2,3-二氨基丙酸过程中，无需添加抗生素和诱导剂，具有成本低、工艺可控、分离提取简便等优点，有利于工业化的生产。
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1.一株产L-2,3-二氨基丙酸的重组大肠杆菌，其特征在于：在出发菌基因组中采用Ptrc启动子异源多拷贝过表达合成L-2,3-二氨基丙酸的基因簇sbnAB；
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：还在所述出发菌基因组中敲除与丝氨酸合成相关的基因；
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：在所述出发菌基因组中还再次利用所述Ptrc启动子，同源过表达与L-2,3-二氨基丙酸代谢途径相关的基因；
4.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括：向所述出发菌基因组中以所述Ptrc启动子驱动插入所述基因簇sbnAB，并将所述基因簇sbnAB在大肠杆菌的染色体DNA上进行多拷贝过表达；
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：还包括在所述发菌基因组中敲除与丝氨酸合成相关的基因的步骤；
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：还包括再次以所述Ptrc启动子驱动所述出发菌基因组中与L-2,3-二氨基丙酸代谢途径相关的基因进行过表达处理的步骤；
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在
8.一种权利要求1～4任一项所述的重组大肠杆菌在发酵生产L-2,3-二氨基丙酸中的应用；
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于：将所述重组大肠杆菌按照体积分数1%～10%的接种量接种到摇瓶培养基中，于34℃～37℃进行摇瓶发酵培养，其中，所述摇瓶培养基包括10～20 g/L 所述简单碳源、1～3 g/L酵母粉、6～8 g/L Na2HPO4、0.3～1 g/L NaCl、2～4g/L KH2PO4、1～5 g/L NH4Cl、1～5 g/L (NH4)2SO4、0.5～2 g/L谷氨酸钠、1～5 g/L MOPS。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：先将所述重组大肠杆菌接种至LB培养基中进行摇瓶放大培养，得到摇瓶种子液；再将所述摇瓶种子液按照体积分数5%～10%的接种量接种到发酵罐培养基中发酵培养，其中，所述发酵罐培养基包括10～20 g/L所述简单碳源、2～5 g/L酵母粉、6～8 g/L Na2HPO4、0.3～1 g/L NaCl、2～4 g/L KH2PO4、1～5 g/L NH4Cl、1～5 g/L (NH4)2SO4、0.5～2 g/L谷氨酸钠、0.1～1 g/L MgSO4，0.1～1 g/L CaCl2；且发酵罐培养过程中的溶氧维持在30%～50%。
...【技术特征摘要】
1.一株产l-2,3-二氨基丙酸的重组大肠杆菌，其特征在于：在出发菌基因组中采用ptrc启动子异源多拷贝过表达合成l-2,3-二氨基丙酸的基因簇sbnab；
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：还在所述出发菌基因组中敲除与丝氨酸合成相关的基因；
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：在所述出发菌基因组中还再次利用所述ptrc启动子，同源过表达与l-2,3-二氨基丙酸代谢途径相关的基因；
4.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括：向所述出发菌基因组中以所述ptrc启动子驱动插入所述基因簇sbnab，并将所述基因簇sbnab在大肠杆菌的染色体dna上进行多拷贝过表达；
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：还包括在所述发菌基因组中敲除与丝氨酸合成相关的基因的步骤；
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：还包括再次以所述ptrc启动子驱动所述出发菌基因组中与l-2,3-二氨基丙酸代谢途径相关的基因进行过表达处理的步骤；
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：包括分别以所述ptrc启动子驱动所述基因簇sbnab，并在大肠杆菌假基因ygay、yjip和mbha位点插入所述基因簇sbnab，获得经三拷贝过表达处...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁其朋，孙新晓，张宇，申晓林，王佳，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
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