【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、基因或染色体的大片段的操纵是用于基础和翻译研究以及疗法开发的有力工具。人基因的大小范围为数百个碱基至至少2,300千碱基(kb)，人染色体的大小范围为38兆碱基对(mb)至近250mb。因此，对大基因、跨越多个基因的区域和部分染色体的有效研究需要操作大的序列片段。然而，大片段操作仍然是基因编辑领域最重要的挑战之一。本公开提供了用于操作大序列的方法。
技术实现思路
1、本公开提供了产生工程化的染色体的方法，其包括：(a)提供细胞，其包含含有靶序列的靶染色体和含有模板序列的模板染色体；(b)使细胞与(i)第一核酸分子和(ii)第二核酸分子接触，所述第一核酸分子从5’至3’包含5’同源臂、至少一个第一标记和3’同源臂，所述5’同源臂含有靶序列5’末端上游的核苷酸序列，所述3’同源臂含有模板序列5’末端上游的核苷酸序列；所述第二核酸分子从5’至3’包含5’同源臂、至少一个第二标记和3’同源臂，所述5’同源臂含有模板序列3’末端下游的核苷酸序列，所述3’同源臂含有靶序列3’末端下游的核苷酸序列；(c)在靶序列处或其两侧，以及在模板序列的5’和3’末端产生双链断裂，从而将模板序列以及第一和第二标记插入靶染色体中；以及(d)选择表达第一和第二标记的一个或多个细胞。
2、在一些实施方案中，在插入模板序列后，第一标记位于模板序列的5’末端，第二标记位于模板序列的3’末端。
3、在一些实施方案中，第一和第二核酸分子的5’和3’同源臂的长度介于约20与2,000个
4、在一些实施方案中，模板序列的长度为至少25千碱基对(kb)、至少50kb、至少100kb、至少200kb、至少400kb、至少500kb、至少600kb、至少700kb、至少800kb、至少900kb、至少1兆碱基对(mb)、至少2mb、至少3mb、至少4mb、至少5mb、至少6mb、至少7mb、至少8mb、至少9mb、至少10mb、至少15mb、至少20mb、至少25mb、至少30mb、至少40mb、至少50mb、至少60mb、至少70mb、至少80mb、至少90mb、至少100mb、至少120mb、至少140mb、至少160mb、至少180mb、至少200mb、至少220mb或至少250mb。在一些实施方案中，模板序列的长度介于50kb与250mb之间、50kb与100mb之间、50kb与50mb之间、50kb与20mb之间、50kb与10mb之间、50kb与5mb之间、50kb与3mb之间、50kb与2mb之间、50kb与1mb之间、100kb与200mb之间、100kb与100mb之间、100kb与50mb之间、100kb与20mb之间、100kb与10mb之间、100kb与5mb之间、100kb与3mb之间、100kb与2mb之间、100kb与1mb之间、100kb与500kb之间、200kb与100mb之间、200kb与50mb之间、200kb与20mb之间、200kb与10mb之间、200kb与5mb之间、200kb与3mb之间、200kb与2mb之间、200kb与1mb之间、200kb与500kb之间、500kb与100mb之间、500kb与50mb之间、500kb与20mb之间、500kb与10mb之间、500kb与5mb之间、500kb与3mb之间、500kb与2mb之间、500kb与1mb之间、1mb与100mb之间、1mb与50mb之间、1mb与20mb之间、1mb与10mb之间、1mb与5mb之间、1mb与3mb之间、1mb与2mb之间、3mb与100mb之间、3mb与50mb之间、3mb与20mb之间、3mb与10mb之间、3mb与5mb之间、5mb与100mb之间、5mb与50mb之间、5mb与20mb之间、5mb与10mb之间、10mb与100mb之间、10mb与50mb之间或在10mb与20mb之间。在一些实施方案中，模板序列的长度介于200kb与50mb之间、介于1mb与20mb之间、介于1mb与10mb之间、介于1mb与5mb之间、介于1mb与3mb之间、介于3mb与20mb之间、介于3mb与10mb之间、介于3mb与7mb之间或介于3mb与5mb之间。
5、在一些实施方案中，在(c)处产生双链断裂包括使用crispr/cas内切核酸酶和一种或多种引导核酸(gna)、一种或多种锌指核酸酶、一种或多种转录激活子样效应因子核酸酶(talen)或一种或多种cre重组酶来诱导双链断裂。在一些实施方案中，crispr/cas内切核酸酶包括casi、casib、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、casx、casy、cpf1(cas12a)、cas12b、cas13a、csyi、csy2、csy3、csei、cse2、csci、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmri、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csbi、csb2、csb3、csx17、csxi4、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csfi、csf2、csf3、csf4、cms1、c2c1、c2c2或c2c3或其同源物、直系同源物(orthologs)或经修饰的形式。在一些实施方案中，crispr/cas内切核酸酶包括cas9、cpf1(cas12a)、cas12b、casx、casy、c2c1或c2c3或其同源物、直系同源物或经修饰的形式。在一些实施方案中，crispr/cas内切核酸酶包括cas9。在一些实施方案中，gna包括单引导rna(sgrna)。
6、在一些实施方案中，靶染色体从5’至3’包含第一核酸分子的5’同源臂序列、靶序列和第二核酸分子的3’同源臂序列。在一些实施方案中，模板染色体从5’至3’包含第一核酸分子的3’同源臂序列、模板序列和第二核酸分子的5’同源臂序列。
7、在一些实施方案中，靶序列包含至少1个基因、至少2个基因、至少3个基因、至少5个基因、至少10个基因、至少20个基因、至少30个基因、至少40个基因、至少50个基因、至少100个基因或至少200个基因。在一些实施方案中，靶序列包含与模板序列的一个或多个基因同源的一个或多个基因。
8、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生工程化的染色体的方法，其包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中在插入所述模板序列后，所述第一标记位于所述模板序列的5’末端，并且所述第二标记位于所述模板序列的3’末端。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子的所述5’和3’同源臂的长度介于约20bp与2,000bp之间、介于约50bp与1,500bp之间、介于约100bp与1,400bp之间、介于约150bp与1,300bp之间、介于约200bp与1,200bp之间、介于约300bp与1,100bp之间、介于约400bp与1,000bp、或介于约500bp与900bp之间或介于约600bp与800bp之间。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子的所述5’和3’同源臂的长度介于约400bp与1,500bp之间、介于约500和1,300bp之间或介于约600和1,000bp之间。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子的所述5’和3’同源臂的长度介于约600bp与1,000bp之间。
6.如权利要求
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述模板序列的长度介于50KB与250MB
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述模板序列的长度介于200KB与50MB
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在(c)中产生所述双链断裂包括使用
10.如权利要求9所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸内切酶包括CasI、CasIB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、CasX、CasY、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas13a、CsyI、Csy2、Csy3、CseI、Cse2、CscI、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、CmrI、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、CsbI、Csb2、
11.如权利要求9所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸内切酶包括Cas9、Cpf1、CasX、CasY、C2c1、C2c3或其同源物、直系同源物或经修饰的形式。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸内切酶包括Cas9。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述gNA包括单一引导RNA(sgRNA)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述靶染色体从5’至3’包含第一核酸分子的5’同源臂序列、靶序列和第二核酸分子的3’同源臂序列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述模板染色体从5’至3’包含第一核酸分子的3’同源臂序列、模板序列和第二核酸分子的5’同源臂序列。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含至少1个基因、至少2个基因、至少3个基因、至少5个基因、至少10个基因、至少20个基因、至少30个基因、至少40个基因、至少50个基因、至少100个基因或至少200个基因。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含与所述模板序列的一个或多个基因同源的一个或多个基因。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述模板序列包含天然存在的序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述模板序列包含对所述天然存在的序列的一个或多个修饰。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述模板序列包含至少1个基因、至少2个基因、至少3个基因、至少5个基因、至少10个基因、至少20个基因、至少30个基因、至少40个基因、至少50个基因、至少100个基因或至少200个基因。
21.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述模板序列包含人工序列。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述人工序列包含编码一种或多种抗体或其抗原结合片段的序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述一种或多种抗体或其抗原结合片段包括scFv、双特异性抗体或多特异性抗体。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中通过插入所述模板序列来删除所述靶序列。
25.如权利要求24所述的方法，其中：
26.如权利要求25所述的方法，其中产生所述双链断裂包括将所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种产生工程化的染色体的方法，其包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中在插入所述模板序列后，所述第一标记位于所述模板序列的5’末端，并且所述第二标记位于所述模板序列的3’末端。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子的所述5’和3’同源臂的长度介于约20bp与2,000bp之间、介于约50bp与1,500bp之间、介于约100bp与1,400bp之间、介于约150bp与1,300bp之间、介于约200bp与1,200bp之间、介于约300bp与1,100bp之间、介于约400bp与1,000bp、或介于约500bp与900bp之间或介于约600bp与800bp之间。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子的所述5’和3’同源臂的长度介于约400bp与1,500bp之间、介于约500和1,300bp之间或介于约600和1,000bp之间。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子的所述5’和3’同源臂的长度介于约600bp与1,000bp之间。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述模板序列的长度为至少25千碱基对(kb)、至少50kb、至少约100kb、至少约200kb、至少约400kb、至少约500
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述模板序列的长度介于50kb与250mb
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述模板序列的长度介于200kb与50mb
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在(c)中产生所述双链断裂包括使用
10.如权利要求9所述的方法，其中所述crispr/cas核酸内切酶包括casi、casib、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、casx、casy、cas12a(cpf1)、cas12b、cas13a、csyi、csy2、csy3、csei、cse2、csci、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmri、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csbi、csb2、
11.如权利要求9所述的方法，其中所述crispr/cas核酸内切酶包括cas9、cpf1、casx、casy、c2c1、c2c3或其同源物、直系同源物或经修饰的形式。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述crispr/cas核酸内切酶包括cas9。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述gna包括单一引导rna(sgrna)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述靶染色体从5’至3’包含第一核酸分子的5’同源臂序列、靶序列和第二核酸分子的3’同源臂序列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述模板染色体从5’至3’包含第一核酸分子的3’同源臂序列、模板序列和第二核酸分子的5’同源臂序列。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含至少1个基因、至少2个基因、至少3个基因、至少5个基因、至少10个基因、至少20个基因、至少30个基因、至少40个基因、至少50个基因、至少100个基因或至少200个基因。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含与所述模板序列的一个或多个基因同源的一个或多个基因。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述模板序列包含天然存在的序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述模板序列包含对所述天然存在的序列的一个或多个修饰。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述模板序列包含至少1个基因、至少2个基因、至少3个基因、至少5个基因、至少10个基因、至少20个基因、至少30个基因、至少40个基因、至少50个基因、至少100个基因或至少200个基因。
21.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述模板序列包含人工序列。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述人工序列包含编码一种或多种抗体或其抗原结合片段的序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述一种或多种抗体或其抗原结合片段包括scfv、双特异性抗体或多特异性抗体。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中通过插入所述模板序列来删除所述靶序列。
25.如权利要求24所述的方法，其中：
26.如权利要求25所述的方法，其中产生所述双链断裂包括将所述细胞与crispr/cas核酸内切酶以及所述第一、第二、第三和第四sgrna接触。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四sgrna包含对所述第一、第二、第三和第四sgrna靶序列特异的靶向序列。
28.如权利要求26所述的方法，其中将所述细胞与crispr/cas核酸内切酶和sgrna接触包括用一种或多种编码所述crispr/cas核酸内切酶和所述sgrna的核酸分子转染所述细胞。
29.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中插入所述模板序列包括几乎不删除或不删除所述靶序列的序列。
30.如权利要求29所述的方法，其中插入所述模板序列破坏了所述靶序列的一种或多种功能。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中插入所述模板序列破坏了所述靶序列中的基因。
32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中
33.如权利要求32所述的方法，其中产生所述双链断裂包括将所述细胞与crispr/cas核酸内切酶以及第一、第二和第三sgrna接触。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述第一、第二和第三sgrna包含对所述第一、第二和第三sgrna靶序列特异的靶向序列。
35.如权利要求34或35所述的方法，其中使所述细胞与所述crispr/cas核酸内切酶和所述sgrna接触包括用编码所述crispr/cas核酸内切酶和所述sgrna的一种或多种核酸分子转染所述细胞。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述第一或第二标记包括荧光蛋白，所述荧光蛋白与能够在所述细胞中表达所述荧光蛋白的启动子可操作地连接。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、青色荧光蛋白(cfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、dsred、
38.如权利要求36所述的方法，其中所述荧光蛋白包括gfp。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述第一标记还包括选择标记。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述第二标记还包括选择标记。
41.权利要求39或40所述的方法，其中所述选择标记选自由以下组成的组：二氢叶酸还原酶(dhfr)、谷氨酰胺合酶(gs)、嘌呤霉素乙酰转移酶、杀稻瘟素脱氨酶、组氨醇脱氢酶、潮霉素磷酸转移酶(hph)、博来霉素抗性基因和氨基糖苷磷酸转移酶(新霉素抗性)。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述第一和第二标记不是相同的选择标记。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述第一标记包含gfp和嘌呤霉素乙酰转移酶，所述gfp与能够在所述细胞中表达gfp的启动子可操作地连接，并且所述第二标记包含潮霉素磷酸转移酶。
44.如权利要求1到43中任一项所述的方法，所述方法还包括(e)在步骤(d)之后删除所述第一或第二标记的全部或部分。
45.如权利要求44所述的方法，其中删除所述第一或第二标记包括用crispr/cas核酸内切酶和gna诱导删除，所述gna包含对编码所述标记的序列特异的靶向序列。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述细胞包括杂交细胞、胚胎杂交干(ehs)细胞或受精卵。
47.如权利要求46所述的方法，其中通过融合来自任何两个物种的es细胞来产生所述ehs细胞，所述物种选自由以下组成的组：小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、绵羊、山羊、驴、牛、马、骆驼、鸡和猴。
48.如权利要求46所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张继伟，魏喻，
申请(专利权)人：上海伊米诺康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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