【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因表达调控、基因编辑和抗病育种，更具体的说是涉及一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法。
技术介绍
1、乳腺炎是全球羊养殖业面临的最大问题之一，是奶山羊养殖业中发病率最高、流行最快、造成损失最严重的一种疾病，防治难度较大，表现为乳腺组织红肿热痛、乳汁性状改变、乳汁体细胞数升高以及不同程度的炎症反应发生，可以细分为临床乳房炎、亚临床乳房炎和隐性乳房炎。乳腺炎不仅给奶山羊养殖业造成严重的经济损失，而且患畜乳汁中的病原微生物及治疗产生的抗生素残留也对人类健康和食品安全构成了一定的威胁。
2、“溶菌酶”具有广谱的抵抗微生物入侵的活性，目前的研究已经证明转入溶菌酶基因的山羊汁中的细菌数量降低，其乳汁在体外可以显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，大大降低乳腺炎的患病率。
3、“调控序列”是一段控制基因表达的dna片段。根据以往研究，乳腺炎发病时tlr4基因会高表达，所以，推测在tlr4核心启动子上游存在一段炎性调控序列，当炎症发生时该炎性调控序列会调节启动子活性，导致基因表达量增高，所以筛选该类调控序列通过基因编辑手段定点插入溶菌酶基因核心启动子上游区域，当炎症发生时诱导溶菌酶高表达，且在安全的生物范围内，从而起到杀菌抗炎的作用。
4、因此，提供一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法，通过
2、本专利技术使用crispr/cas9技术结合电转染获得溶菌酶基因编辑奶山羊胎儿成纤维细胞，通过体细胞克隆技术和胚胎移植技术创制基因编辑克隆羊。体外实验表明，将基因编辑克隆羊乳腺上皮细胞分离，让其在乳腺炎致病菌感染造成的炎症条件下，溶菌酶转录水平表达量显著提升，从而提高自身杀菌抗炎能力，抵御外来病原菌，从而降低乳腺炎的发病率。
3、目前，还没有针对炎性条件下提高内源性溶菌酶的有效策略以及克隆羊的创制，所以本专利技术是首创，处于国际领先水平。
4、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
5、一种供体载体，由pmd19-t载体与5’arm-loxp-ef-1α-egfp-p2a-puro-sv40 poly(a)-loxp-regulatory sequence-3’arm组成；所述5’arm-loxp-ef-1α-egfp-p2a-puro-sv40 poly(a)-loxp-regulatory sequence-3’arm的序列如seq id no.30所示。
6、进一步，一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法，将cas9-sgrna4和所述的供体载体共转染宿主细胞；
7、所述sgrna4的序列如下：acaccatgaattgcactcca；seq id no.14。
8、进一步，所述cas9-sgrna4的载体骨架为pspcas9(bb)-2a-gfp。
9、进一步，所述宿主细胞为胎儿成纤维细胞。
10、进一步，所述的供体载体或所述的基因编辑方法在提高溶菌酶表达水平中的应用。
11、进一步，所述的供体载体或所述的基因编辑方法在制备防治乳腺炎制剂中的应用。
12、进一步，所述的供体载体或所述的基因编辑方法在制备抵抗乳腺炎致病菌制剂中的应用。
13、进一步，所述的供体载体或所述的基因编辑方法在抗乳腺炎奶山羊育种中的应用。
14、进一步，一种溶菌酶启动子区基因编辑位点，序列如下：acaccatgaattgcactcca；seq id no.14。
15、进一步，一种奶山羊炎性调控序列，序列为seq id no.30中第3728-4228bp。
16、构建“调控序列-溶菌酶启动子”基因供核载体，结合电转染方法定点整合到基因组并筛选无筛选标记阳性基因编辑胎儿成纤维细胞，通过体细胞克隆和胚胎移植技术获得基因编辑克隆羊，羔羊体况良好，正常存活，无异常表现，经过鉴定为定点整合基因组，这表明该位点是安全的，使用lps处理从基因编辑克隆羊分离出来的乳腺上皮细胞，通过实验结果可知，溶菌酶mrna表达量显著提高。
17、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法，lps感染造成的炎性条件下，乳腺上皮细胞表达溶菌酶的含量显著提高，从而对乳腺炎致病菌具有拮抗作用。
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1.一种供体载体，其特征在于，由pMD19-T载体与5’arm-LOXP-EF-1α-EGFP-P2A-Puro-SV40 poly(A)-LOXP-Regulatory sequence-3’arm组成；所述5’arm-LOXP-EF-1α-EGFP-P2A-Puro-SV40 poly(A)-LOXP-Regulatory sequence-3’arm的序列如SEQ ID NO.30所示。
2.一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法，其特征在于，将Cas9-SgRNA4和权利要求1所述的供体载体共转染宿主细胞；
3.根据权利要求2所述的一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法，其特征在于，所述Cas9-SgRNA4的载体骨架为pSpCas9(BB)-2A-GFP。
4.根据权利要求2所述的一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法，其特征在于，所述宿主细胞为胎儿成纤维细胞。
5.权利要求1所述的供体载体或权利要求2-4任一项所述的基因编辑方法在提高溶菌酶表达水平中的应用。
6.权利要求1
7.权利要求1所述的供体载体或权利要求2-4任一项所述的基因编辑方法在制备抵抗乳腺炎致病菌制剂中的应用。
8.权利要求1所述的供体载体或权利要求2-4任一项所述的基因编辑方法在抗乳腺炎奶山羊育种中的应用。
9.一种溶菌酶启动子区基因编辑位点，其特征在于，序列如下：ACACCATGAATTGCACTCCA；SEQ ID NO.14。
10.一种奶山羊炎性调控序列，其特征在于，序列为SEQ ID NO.30中第3728-4228bp。
...【技术特征摘要】
1.一种供体载体，其特征在于，由pmd19-t载体与5’arm-loxp-ef-1α-egfp-p2a-puro-sv40 poly(a)-loxp-regulatory sequence-3’arm组成；所述5’arm-loxp-ef-1α-egfp-p2a-puro-sv40 poly(a)-loxp-regulatory sequence-3’arm的序列如seq id no.30所示。
2.一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法，其特征在于，将cas9-sgrna4和权利要求1所述的供体载体共转染宿主细胞；
3.根据权利要求2所述的一种提高奶山羊抗乳腺炎基因溶菌酶表达的基因编辑方法，其特征在于，所述cas9-sgrna4的载体骨架为pspcas9(bb)-2a-gfp。
4.根据权利要求2所述的一种提高奶山羊抗乳腺炎...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，冯瑞，赵江林，李卉佳，马湘海，张峻瑜，张倩，刘旭，张涌，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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