【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物及其制备方法和应用。
技术介绍
1、寡核苷酸药物包括反义寡核苷酸(aso)、小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、适配体(aptamer)等，其在药物设计、精准治疗等方面相对于小分子药物具有巨大优势。传统小分子药物的发现主要依靠化学合成、筛选和优化，存在效率低、成本高等问题，此外，由于一些致病蛋白缺乏与小分子药物相互作用的口袋(hydrophobic pockets)，相应的疾病无法用小分子药物治疗。而寡核苷酸类药物只需通过改变碱基序列就能够获得针对不同疾病的药物，在新药设计与发现方面具有天然优势，且寡核苷酸药物能够通过精确的碱基互补原则结合目标基因，从而调控基因表达，直接作用于致病基因本身而不是致病蛋白，因此，寡核苷酸药物具有特异性高、高效、不易产生耐药性等优势。其中，aso既可以与mrna杂化形成杂合体诱导核糖核酸酶h(rnase h)降解mrna，又可以与mrna5’非翻译区结合阻碍目标mrna表达，还可以针对前体mrna进行剪切调控，是目前最具优势的基因治疗药物之一。
2、但是寡核苷酸药物的成药性通常不理想，其酶稳定性差、血浆清除率高、细胞膜透过率低等。目前已上市的寡核苷酸药物均采用不同方式的化学修饰(核酸碱基、糖环、骨架)来增加其酶稳定性。然而高剂量化学修饰的寡核苷酸易导致强烈免疫反应、肝损伤以及脱靶效应等。因此，亟需开发针对寡核苷酸药物的新型递送系统。
3、由于病毒载体制备昂贵且通常会引起免疫反应，现有技术中，
4、缀合物递送方面进展较快，目前已有三款基于n-乙酰半乳糖胺(galnac，特异性靶向肝细胞膜表面受体)的药物获批上市。公开号为cn110959011a的中国专利文献公开了一种缀合物，该缀合物能够特异性地靶向肝细胞，从而有效解决寡核苷酸药物的体内递送的相关问题，毒性低，并在保持所递送的寡核苷酸高度稳定的同时，还具有优异的递送效率；公开号为cn115282283a的中国专利文献公开了一种小分子药物-寡核苷酸偶联物，一方面寡核苷酸优异的亲水性可改善小分子药物的溶解性质，改善其体内组织分布，促进递送和吸收，另一方面，疏水性小分子药物反过来也可促进寡核苷酸的入胞，从而提升其对靶标基因的调控能力。
5、现有技术中寡核苷酸药物载体以脂质纳米颗粒和galnac缀合物为主，大多靶向肝脏。因此，开发安全的非肝脏靶向的、生物相容性良好的、稳定性良好的递送载体成为寡核苷酸药物研发中的重要研究方向。
技术实现思路
1、为了解决寡核苷酸药物酶稳定性差、血浆清除率高、细胞膜透过率低的问题，本专利技术利用刷状高分子聚合物作为寡核苷酸药物递送载体，提供了一种刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物，该缀合物能够自发形成离散的纳米颗粒，屏蔽寡核苷酸的负电荷，提高寡核苷酸的细胞摄取率和酶稳定性。
2、具体采用的技术方案如下：
3、刷状高分子聚合物在作为寡核苷酸药物递送载体中的应用，所述的刷状高分子聚合物的结构式如式(i)所示：
4、
5、a表示聚乙二醇的重复单元数，a为20-500的整数，b表示连接子聚乙二醇的重复单元数，b为2-20的整数，c表示保护性聚乙二醇的重复单元数，c为70-500的整数，m和n分别表示接枝不同侧链的聚赖氨酸的重复单元数，m为10-300的整数，n为10-300的整数，r的结构式为下式所示的任一种，*表示连接位置；
6、
7、该刷状高分子聚合物由一条主链和密集排列在主链上的线性高分子侧链构成，刷状高分子聚合物相邻侧链间存在巨大的空间位阻，侧链相互排斥并向外延伸，于是，刷状高分子聚合物在溶液中无需自组装就能够形成离散的纳米颗粒结构，使其成为理想的寡核苷酸药物递送载体，能够屏蔽寡核苷酸的负电荷，提高寡核苷酸的细胞摄取率，减少寡核苷酸与其他大分子之间的相互作用，提高其对核酸酶的抗性。
8、该刷状高分子聚合物的生物相容性好，具有多种官能团结构，便于寡核苷酸药物的装配。
9、本专利技术还提供了一种刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物，结构式如式(ⅱ)所示：
10、
11、式(ⅱ)中，a、b、c、m、n、r1的定义与式(i)相同，aso表示寡核苷酸药物，r2的结构式为下式所示的任一种，*表示连接位置；
12、
13、本专利技术通过共价键作用构建刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物，而非自组装结构，使其结构稳定、同时能够屏蔽寡核苷酸的负电荷，提高寡核苷酸的细胞摄取率和酶稳定性。
14、具体的，所述的寡核苷酸药物为9-30个碱基长度的核苷酸序列。
15、本专利技术还提供了所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物的制备方法，包括以下步骤：
16、(1)将具有树枝状结构的聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物溶解于有机溶剂中，加入三乙胺，再加入叠氮四聚乙二醇琥珀酰亚胺溶液，搅拌反应，经过后处理得到第一中间体；
17、(2)制备第一中间体的水溶液，利用点击化学反应，将第一中间体的水溶液与环丙烷环辛炔-甲氧基聚乙二醇水溶液或二苯并环辛炔-甲氧基聚乙二醇水溶液混合，搅拌反应，得到第二中间体；
18、(3)制备第二中间体的水溶液，利用点击化学反应，将第二中间体的水溶液与环丙烷环辛炔-aso水溶液或二苯并环辛炔-aso水溶液混合，再加入尿素破坏寡核苷酸之间的氢键错配，搅拌反应，经过后处理得到所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物。
19、优选的，所述的具有树枝状结构的聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物中，聚赖氨酸嵌段的重复单元数为20-600，聚乙二醇嵌段的重复单元数为20-500。
20、优选的，步骤(1)中，反应条件为20-30℃，10-20h。
21、优选的，步骤(2)中，反应条件为反应条件为20-30℃，10-20h。
22、优选的，步骤(3)中，反应条件为反应条件为60-80℃，16-20h。
23、优选的，步骤(3)加入尿素后，尿素在反应体系中的浓度为2-5m。
24、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
25、(1)寡核苷酸药物带负电荷，细胞膜也带负电荷，单独的寡核苷酸药物难以进入细胞，且寡核苷酸药物容易被体内核酸酶降解，影响其作用效果，本专利技术利用刷状高分子聚合物作为寡核苷酸药物递送载体，增加了寡核苷酸药物的疏水性，能够屏蔽寡核苷酸的负电荷，提高寡核苷酸的细胞摄取率，以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.刷状高分子聚合物在作为寡核苷酸药物递送载体中的应用，其特征在于，所述的刷状高分子聚合物的结构式如式(I)所示：
2.一种刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物，其特征在于，结构式如式(Ⅱ)所示：
3.根据权利要求2所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物，其特征在于，所述的寡核苷酸药物为9-30个碱基长度的核苷酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物的制备方法，其特征在于，所述的具有树枝状结构的聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物中，聚赖氨酸嵌段的重复单元数为20-600，聚乙二醇嵌段的重复单元数为20-500。
6.根据权利要求4所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应条件为20-30℃，10-20h。
7.根据权利要求4所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反应条件为20-30℃，10-20h。
8.根据
9.根据权利要求4所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)加入尿素后，尿素在反应体系中的浓度为2-5M。
...【技术特征摘要】
1.刷状高分子聚合物在作为寡核苷酸药物递送载体中的应用，其特征在于，所述的刷状高分子聚合物的结构式如式(i)所示：
2.一种刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物，其特征在于，结构式如式(ⅱ)所示：
3.根据权利要求2所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物，其特征在于，所述的寡核苷酸药物为9-30个碱基长度的核苷酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的刷状高分子聚合物-寡核苷酸缀合物的制备方法，其特征在于，所述的具有树枝状结构的聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物中，聚赖氨酸嵌段的重复单元数为20-6...
【专利技术属性】
技术研发人员：路浩东，贾飞，程向东，李庆勇，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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