【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析检测，尤其涉及一种花粉变应原制剂中致敏蛋白的定量检测方法。
技术介绍
1、过敏性疾病是全球性重大卫生问题之一。工业化国家超过25％的人口被过敏性哮喘、过敏性鼻结膜炎及过敏性皮炎困扰，其中以过敏性哮喘最为常见。吸入性致敏花粉是引发过敏性哮喘及其他呼吸道过敏性疾病的最重要因素。susanne vrtala等调查发现近50％的过敏性疾病患者对草类花粉过敏(susanne vrtala,sabine fischer,et.al；molecular,immunological,and structural characterization of phl p 6,a major allergen andp-particle-associated protein from timothy grass(phleum pratense)pollen1.jimmunol 1november1999；163(10):5489–5496.)。
2、葎草(humulus scandens)，荨麻目桑科葎草属，一年或多年生草本植物，主要分布在北半球温带和亚热带地区，远东地区报道较为多见。常生于沟边、荒地、废墟、林缘边；花期为7-9月(乔秉善.中国气传花粉和植物彩色图谱[m].北京:中国协和医科大学出版社,2005:83-85.)。
3、近年来发现葎草花粉已成为我国及东亚地区夏秋季节仅次于蒿属花粉的重要致敏原。1993年，孙秀珍报道对西安地区支气管哮喘的患者以葎草花粉浸液做皮试试验，54％的患者有阳性反应，仅次于藜草
4、在临床检验中，酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)是蛋白质定量分析的常规技术，灵敏度高，特异性好，但是elisa在多重蛋白质生物标志物的测定方面具有一定限制，它过分依赖于抗体的量与质量。此外，对于花粉症，变应原特异性免疫治疗(allergen specific immunotherapy，sit)需要花粉体内诊断制剂及治疗制剂。由于花粉变应原制剂成分复杂，致敏蛋白成分远不止一种，目前市面上针对各个致敏蛋白组分的抗体也少之极少，花粉制剂暂时并没有标准化制剂。
5、因此，研究获得一种花粉变应原制剂中致敏蛋白的绝对定量方法，实现花粉变应原制剂标准化是非常必要的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种花粉变应原制剂中致敏蛋白的定量检测方法，所述定量检测方法具有高通量、高灵敏度、高特异性、高准确度、重复性好、稳定可靠、成本低等优点；可实现花粉变应原制剂标准化，也进一步实现对花粉变应原制剂的精确质控，提高花粉变应原制剂的质量，推动变应原特异性免疫治疗的精准化。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种花粉变应原制剂中致敏蛋白的定量检测方法，包括如下步骤：
4、(1)将花粉变应原参考品预处理后，酶解，得到花粉变应原肽段；
5、(2)将花粉变应原肽段进行lc-ms分析，筛选目标特异性肽段，合成筛选获得的目标特异性肽段的重标肽；
6、(3)将待测花粉变应原制剂预处理后，酶解，得到待测花粉肽段，然后利用步骤(2)合成的重标肽为标准品，进行mrm测定，获得待测花粉变应原制剂中致敏蛋白的绝对含量。
7、作为优选，步骤(1)所述预处理包括使用二硫苏糖醇、碘乙酰胺处理，所述预处理的温度为55-65℃，所述预处理的时间为20-40min。
8、作为优选，步骤(1)预处理后、酶解前进行离心，所述离心的离心力为13000-14000g，所述离心的时间为20-40min。
9、作为优选，步骤(1)所述酶解过程中使用的酶与花粉变应原参考品的体积比为1:(8-12)，所述酶解的时间为14-19h，所述酶解的温度为36-38℃。
10、作为优选，步骤(2)所述lc-ms分析过程中，柱温为38-42℃，进样体积为8-12μl，流动相为水和乙腈溶液，流速为0.2-0.4ml/min。
11、作为优选，步骤(2)所述目标特异性肽段的筛选标准为强度高，可信度conf≥85％。
12、作为优选，步骤(2)所述重标肽为对目标特异性肽段中的氨基酸进行同位素标记获得。
13、作为优选，所述花粉包括葎草花粉。
14、作为优选，所述致敏蛋白包括hum s3。
15、作为优选，所述目标特异性肽段包括lppgacidsenyr、yyqncvmk、actslydk。
16、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
17、本专利技术所述定量检测方法具有高通量、高灵敏度、高特异性、高准确度、重复性好、稳定可靠、成本低等优点；与mrm技术的结合可实现花粉变应原制剂标准化，也进一步实现对花粉变应原制剂的精确质控，提高花粉变应原制剂的质量，推动变应原特异性免疫治疗的精准化。本专利技术中根据所述定量检测方法筛选出了葎草花粉致敏蛋白hum s3的目标特异性肽段lppgacidsenyr、yyqncvmk、actslydk，这为变应原的精准定量提供了稳定可靠的基础。
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1.一种花粉变应原制剂中致敏蛋白的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述预处理包括使用二硫苏糖醇、碘乙酰胺处理，所述预处理的温度为55-65℃，所述预处理的时间为20-40min。
3.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)预处理后、酶解前进行离心，所述离心的离心力为13000-14000g，所述离心的时间为20-40min。
4.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述酶解过程中使用的酶与花粉变应原参考品的体积比为1:(8-12)，所述酶解的时间为14-19h，所述酶解的温度为36-38℃。
5.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)所述LC-MS分析过程中，柱温为38-42℃，进样体积为8-12μL，流动相为水和乙腈溶液，流速为0.2-0.4mL/min。
6.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)所述目标特异性肽段的筛选标准为可信度Conf≥85％。
7.根据权利
8.根据权利要求1-7任一项所述的定量检测方法，其特征在于，所述花粉包括葎草花粉。
9.根据权利要求1-7任一项所述的定量检测方法，其特征在于，所述致敏蛋白包括Hums3。
10.根据权利要求1-7任一项所述的定量检测方法，其特征在于，所述目标特异性肽段包括LPPGACIDSENYR、YYQNCVMK、ACTSLYDK。
...【技术特征摘要】
1.一种花粉变应原制剂中致敏蛋白的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述预处理包括使用二硫苏糖醇、碘乙酰胺处理，所述预处理的温度为55-65℃，所述预处理的时间为20-40min。
3.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)预处理后、酶解前进行离心，所述离心的离心力为13000-14000g，所述离心的时间为20-40min。
4.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述酶解过程中使用的酶与花粉变应原参考品的体积比为1:(8-12)，所述酶解的时间为14-19h，所述酶解的温度为36-38℃。
5.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)所述lc-ms分...
【专利技术属性】
技术研发人员：周俊雄，尹佳，邵文丽，郑昕，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：
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