【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物分离培养，特别涉及一种从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法。
技术介绍
1、石油作为重要的能源，在现代经济发展中起着重要的作用。然而，石油在开采、运输、贮藏、加工过程中往往会因意外事故或管理不当导致溢油污染事件频发，给周边环境造成了严重污染，直接危害人类生产与生活。因此，如何经济、高效、安全地修复石油污染环境，已成为生态环境保护亟待解决的问题。
2、目前，微生物修复具有成本低、环境友好等优势，已被广泛应用于石油污染修复治理中。现已有两百种具有石油烃降解能力的微生物被发现并报道。醋酸钙不动杆菌、不动杆菌、蒙氏假单胞菌和乳酸不动杆菌、芽孢杆菌、恶臭假单胞菌等是常见的石油降解细菌。然而，这些菌大都是基于营养丰富条件下培养获得的，对石油污染条件下贫养环境适应性差。研究表明，当环境中c:p:n为100:5～10:1时，微生物的生长繁殖及代谢活性最高，微生物具有最佳的石油烃的降解效率。然而，在石油污染环境中，由于石油烃含量骤增，会加剧环境中氮和磷含量的相对缺乏，这将抑制微生物的生长，导致石油烃的降解效率受到限制。因此，在石油污染环境中，养分可用性成了石油烃污染微生物修复的主要阻力。
3、磷是一切生物体生长发育的主要元素之一，是生物体内核酸、多种酶和atp等的重要组成成分，对维持生物体生命活动具有重要作用。我国土壤环境中95％以上的磷以无效态形式存在于土壤中，微生物很难吸收利用。在传统的修复技术方法中，往往通过添加外源的磷肥来要调节污染环境中的碳磷比例。然而，微生物对施入环境中磷肥利用效率
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提出一种寡磷液体培养基，其1l的配方为：ca3(po4)2 1-2g；(nh4)2so4 0.5-0.8g；nacl 0.5g；kcl 0.5g；mgso4·7h2o 0.4g；feso4·7h2o 0.04g；mnso4·4h2o 0.03-0.05g；蒸馏水定容至1l；ph 7.0-7.5。
2、本专利技术还提供一种寡磷固体培养基，其1l的配方为：ca3(po4)2 1-2g；(nh4)2so40.5-0.8g；nacl 0.5g；kcl 0.5g；mgso4·7h2o 0.4g；feso4·7h2o 0.04g；mnso4·4h2o0.03-0.05g；琼脂粉10-20g；蒸馏水定容至1l；ph 7.0-7.2。
3、本专利技术还提出了所述培养基在从石油污染物分离与纯化寡磷石油烃降解菌的应用。
4、本专利技术还提供一种从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，所述方法包括：
5、采集石油污染物，加水制备悬浮液进行震荡培养；
6、制备所述的寡磷液体培养基，将所述寡磷液体培养基与培养后的悬浮液进行混合震荡培养；
7、利用含有原油的寡磷液体培养基对混合培养后的培养液进行驯化培养；
8、制备原油-寡磷固体培养基，将所得驯化后的培养液进行稀释，将稀释液涂布于所述原油-寡磷固体培养基上并进行静置培养；
9、通过多次划线分离与纯化得到形态一致的纯化菌株，则从石油污染物中分离得到了寡磷石油烃降解菌；
10、将单菌落在寡磷液体培养基中扩大培养后，测定目标菌株在寡磷条件下石油烃的降解能力。
11、进一步的，所述石油污染物包括石油污染土壤或石油污染水体。
12、进一步的，加水制备悬浮液进行震荡培养的条件为25-30℃、150-180r/min，培养1-2天；
13、将所述寡磷液体培养基与培养后的悬浮液进行混合震荡培养的条件为25-30℃、150-180r/min转速，培养时间5-8天，其中，所述寡磷液体培养基和所述培养后的悬浮液用量的体积比为9:1-10:1。
14、进一步的，利用含有原油的寡磷液体培养基对混合培养后的培养液进行驯化培养的条件为25-30℃、150-180r/min转速，培养5-7天，在此条件下循环驯化4-6次，所述含有原油的寡磷液体培养基的含油量为1％，3％，5％，10％w/v。
15、进一步的，制备原油-寡磷固体培养基包括：
16、制备如权利要求2所述的寡磷固体培养基；
17、将原油溶于正己烷中，配成10％(v/v)的第一溶液；
18、按照所述第一溶液与所述寡磷固体培养基融化状态体积比为1：1000的比例吸取所述第一溶液涂布于所述寡磷固体培养基上；
19、待所述正己烷挥发完全，配置成原油-寡磷固体培养基。
20、进一步的，将所得驯化后的培养液进行稀释包括对所得驯化后的培养液进行连续10倍稀释，分别为10-3、10-4、10-5、10-6的4个稀释梯度；
21、将稀释液涂布于所述原油-寡磷固体培养基上并进行静置培养的条件为25-30℃培养2-4天。
22、进一步的，通过多次划线分离与纯化得到形态一致的纯化菌株包括：
23、选取不同形态的优势单菌落，在原油-寡磷固体培养基上多次划线分离，以得到形态一致的纯化菌株；其中，所述不同形态包括颜色、表面、形状、隆起和边缘。
24、进一步的，测定目标菌株在寡磷条件下石油烃的降解能力包括：
25、调整所述扩大培养结束后的菌液初始密度，取上述菌液分别接种到含有1-10％w/v原油的寡磷液体培养基中，在25-30℃、150-180r/min转速的条件下连续培养28天，萃取培养后的残油，确定原油降解率。
26、进一步的，所述菌液初始密度调整为od600＝0.4-0.6，测定目标菌株在寡磷条件下石油烃降解能力所用的菌液量与所述培养基量的体积比为1:20-1:19。
27、本专利技术的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，有利于筛选适应寡磷环境的石油烃降解的微生物，可以克服石油污染环境中养分缺乏问题，提高微生物石油烃降解效率，将会突破贫养环境下石油污染场地修复工作的技术瓶颈；弥补常规方法大多能获得适应于营养丰富条件下的微生物菌株，忽略了针对石油污染环境环境下寡营养型的石油烃降解菌的不足，本专利技术采用ca3(po4)2寡营养培养基分离与纯化可耐受难溶性磷的石油烃降解菌，有益于寡磷营养型石油烃降解的分离、筛选，有助于提高微生物在寡营养环境下的适应性，促进微生物的石油烃降解能力。本专利技术在减污降碳绿色可持续发展的大背景下，具有良好的应用前景。
28、本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种寡磷液体培养基，其特征在于，
2.一种寡磷固体培养基，其特征在于，
3.一种如权利要求1-2任一项所述的培养基在从石油污染物分离与纯化寡磷石油烃降解菌的应用。
4.一种从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根据权利要求4所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，所述石油污染物包括石油污染土壤或石油污染水体。
6.根据权利要求4或5所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，
8.根据权利要求6所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，制备原油-寡磷固体培养基包括：
9.根据权利要求8所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，
10.根据权利要求6所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，通过多次划线分离与纯化得到形态一致的纯
11.根据权利要求6所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，测定目标菌株在寡磷条件下石油烃的降解能力包括：
12.根据权利要求11所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，所述菌液初始密度调整为OD600＝0.4-0.6，测定目标菌株在寡磷条件下石油烃降解能力所用的菌液量与所述培养基量的体积比为1:20-1:19。
...【技术特征摘要】
1.一种寡磷液体培养基，其特征在于，
2.一种寡磷固体培养基，其特征在于，
3.一种如权利要求1-2任一项所述的培养基在从石油污染物分离与纯化寡磷石油烃降解菌的应用。
4.一种从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根据权利要求4所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，所述石油污染物包括石油污染土壤或石油污染水体。
6.根据权利要求4或5所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油烃降解菌的方法，其特征在于，
8.根据权利要求6所述的从石油污染物中分离与纯化寡磷石油...
【专利技术属性】
技术研发人员：李兴春，李丹丹，杜显元，王清威，郑瑾，吴慧君，宋佳宇，
申请(专利权)人：中国石油天然气集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。