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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开总体上涉及免疫学的领域,并且更具体地涉及抗体分析和抗体谱的评估。
技术介绍
1、抗体是适应性免疫系统的主要效应子中的一种效应子。抗体结合抗原的能力已被利用以生成用于诊断、研究和临床应用的若干工具。抗体跻身临床试验中发展最快的生物分子之列,并且估计在2020年的全球市场为1309亿,并且预计在2025年底增长到2237亿(https://www.marketdataforecast.com/market-reports/antibodies-market)。
2、抗体被分类为糖蛋白。抗体由四个多肽链构成:由二硫桥连接在一起的重链(h,55kda)和轻链(l,25kda)两者的两个相同拷贝。基本形状类似于“y”形。每个多肽链具有恒定区和可变区,所述恒定区在抗体中是保守的,并且所述可变区对于每个抗体是特定的,因此主要负责赋予抗原亲和力。
3、从应用的角度来看,抗体可以被分为两个主要类别:单克隆抗体(mab),所述单克隆抗体由单一类型的浆细胞产生,并且具有相同的重链和轻链序列,并与给定抗原上的唯一表位结合。另一方面,多克隆抗体(pab)由来自不同b细胞的一群不同抗体组成,所述抗体识别同一抗原的类似部分和不同部分两者;这些区域被称为表位。
4、抗体由浆细胞分泌,所述浆细胞是分化的成熟b淋巴细胞(pioli 2019)。浆细胞响应于抗原产生多种抗体。1975年,开发了杂交瘤技术以使单个浆细胞永生(packer 2021)。由表示为克隆的均质永生化浆细胞群体产生的抗体被称为单克隆抗体(mab)。与之相
5、单克隆抗体被开发并用于若干生物学应用、诊断和临床应用,如用于自身免疫性疾病、癌症和传染病的治疗,仅举几例。然而,mab疗法是复杂得多的天然免疫应答的简化版本,其涉及靶向不同表位的若干不同抗体(wang等人2013)。
6、另一方面,pab治疗可用于如狂犬病等特定病例。治疗是基于使用人狂犬病免疫球蛋白(hrig)或更便宜和安全的马版本(erig)。这两者都从接种狂犬病疫苗的人供体或马的混合血清中获得。与hrig使用相关的其它问题包含潜在的健康风险、批次之间的差异以及在世界某些地区或由于意外的大规模接触而导致的全球供应有限。bakker等人展示出,通过合并靶向狂犬病病毒糖蛋白的不同表位的几种不同单克隆抗体再现pab混合物可以有效地针对不同的街头狂犬病病毒以及针对病毒的逃逸突变体(bakker,2005)。
7、产生mab或pab或用其进行研究的选择取决于不同的因素,包含应用类型、生产成本和时间以及技术专长。mab和pab两者都具有不同的优点和缺点。多克隆抗体可以比mab更快地产生,并且对技术的要求也更低,因为所需要的只是用靶抗原和佐剂接种动物。另外,pab是天然异质的,这保证了其可以识别不同构象下或具有微小变化的给定表位,pab在缓冲液使用和表位变化方面也更加灵活。此外,由不同动物产生的pab会表现出不同的亲和力,并且可以预期动物体内的剧烈变化。
8、与pab不同,mab是均质的,并且因此批次之间的差异较低,但在一些情况下其高特异性可能限制其使用;例如,表位结构的微小变化可能极大地影响抗体抗原亲和力。此外,由于mab由通常通过融合b细胞和骨髓瘤细胞产生的相同的永生化b细胞产生,因此可以在体外以给定的特异性维持其产生。
9、然而,杂交瘤细胞可能遭受基因丢失、基因突变、杂交瘤中发现的另外链以及细胞系漂移。在mab中鉴定的这一后期问题可以使用重组抗体(rab)来克服。对于重组抗体rab,必须确定抗体序列以合成免疫球蛋白(ig)l链和h链基因并产生表达构建体。然后将构建体转染到如cho或hek293等高产量细胞中。
10、类似的策略可以应用于pab。因此,能够对来自多克隆混合物的若干抗体(至少是其主要优势形式中的一些抗体)进行测序以产生重组体来产生更简单的复杂混合物,如重组寡克隆混合物是有吸引力的解决方案,这结合了mab和rab双方(去除批次之间的差异,避免杂交瘤的损失)以及pab(更接近自然免疫系统的应答的应答)的优势。迄今为止,很少有人试图对pab进行测序。
11、在由cheung等人开发的方法中,首先从经免疫的动物中富集抗体,并使用对通过经免疫的动物的b细胞ig库的下一代测序(ngs)创建的参考数据库进行检索的基于标准蛋白质组学质谱法(ms)的方法进行分析。通过探索h链和l链的所有可能组合来完成h链和l链的配对。wine等人(2013).
12、guthals等人2016提出了相对类似的方法,提供了对源自通过来自暴露于巨细胞病毒的个体的糖蛋白b抗原亲和进行纯化的多克隆混合物的混合物进行测序的实例;设法完成了对若干h链和l链的测序,并集中精力于前四个lc和七个hc。这些人不得不生成在哺乳动物细胞中表达的所有可能的成对组合来验证抗原结合。与之前的尝试一样,所遇到的主要问题是通过组合方法盲目地探索配对;这种h和l配对方法对于少量抗体是可行的,但对于大数据集是不可能的或要求太高的,因为这是已鉴定的l链数与已鉴定的h链数的乘法乘积。
13、在不同的著作中已讨论了适当配对的重要性。czerwinski等人(1998)强调了通过筛选嵌合抗体抗原结合结构域(fab)文库的适当配对的重要性。brandon等人(2013)解决了通过进行单个b细胞测序的h/l配对。jared shaw(2020)提出了使用自上向下和自中向下质谱法方法的直接链配对;其所提出的方法依赖于对不同序列的完整了解以在对内识别,并且只能在完整的片段上进行。
14、用于从大群体中识别抗体或若干种抗体的大多数建议策略都是通过蛋白质组学或转录组学进行的;测序策略是在其中h链和l链在降低分离条件下(即二硫键被破坏,并且分子被碎片化)的样品上进行的,并且因此在测序过程中h/l配对信息丢失。通常用于确定合适的h/l对的主要策略中的一种仅仅由通过表达所有可能的组合来生成所有排列以及进行功能分析组成,这对于复杂的样品来说可能是繁琐的任务。
15、因此需要新的方法来鉴定复杂抗体混合物中(如多克隆抗体混合物中)的轻链和重链对,或者至少减少要考虑的可能有效配对的数量。
16、本说明书参考多个文献,所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。
技术实现思路
1、本公开提供了以下条款1至32:
2、1.一种用于确定抗体和/或抗体片段混合物中的抗体或抗体片段的重链和轻链配对的方法,所述方法包括:(a)使所述混合物在非还原条件下经受分离步骤,以获得分离的抗体或抗体片段的级分;(b)消化所述级分中的所述分离的抗体或抗体片段,以获得抗体或抗体片段肽;(c)分析所述抗体或抗体片段肽;以及(d)基于所述分析确定本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于确定抗体和/或抗体片段混合物中的抗体或抗体片段的重链和轻链配对的方法,所述方法包括:(a)使所述混合物在非还原条件下经受分离步骤,以获得分离的抗体或抗体片段的级分;(b)消化所述级分中的所述分离的抗体或抗体片段,以获得抗体或抗体片段肽;(c)分析所述抗体或抗体片段肽;以及(d)基于所述分析确定所述抗体或抗体片段的重链和轻链配对。
2.一种用于确定抗体和/或抗体片段混合物中的抗体或抗体片段的重链和轻链配对的方法,所述方法包括:(i)使所述混合物与交联剂接触,以获得交联的抗体或抗体片段;(ii)消化所述交联的抗体或抗体片段,以获得交联的抗体或抗体片段肽;(iii)分析所述交联的抗体或抗体片段肽;以及(iv)基于所述分析确定所述抗体或抗体片段的重链和轻链配对。
3.根据权利要求1所述的方法,其中在非还原条件下的所述分离步骤包括使所述抗体和/或抗体片段混合物经受色谱法。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述色谱法是疏水相互作用色谱法(HIC)。
5.根据权利要求1所述的方法,其中在非还原条件下的所述分离步骤包括在凝胶上迁移所述
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述凝胶是聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其中所述凝胶是天然凝胶。
8.根据权利要求5或6所述的方法,其中所述凝胶是变性2D凝胶。
9.根据权利要求1所述的方法,其中在非还原条件下的所述分离步骤包括使所述抗体和/或抗体片段混合物经受毛细管电泳法。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述毛细管电泳法是成像毛细管等电聚焦(iCIEF)。
11.根据权利要求1和3至10中任一项所述的方法,其进一步包括使所述抗体和/或抗体片段混合物与以序列特异性方式使蛋白质分子的电荷改性的药剂接触。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述药剂使带正电的残基改性为中性或带负电的基团。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述药剂是柠康酸酐(CA)或磺基-NHS-乙酸酯(SNA)。
14.根据权利要求2所述的方法,其中所述交联剂包括两个N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)酯基。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述交联剂是二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括在所述消化之前使半胱氨酸残基还原和烷基化。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述抗体和/或抗体片段混合物是多克隆抗体混合物或单克隆抗体的混合物。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法,其中所述消化包括使所述抗体或抗体片段与至少一种蛋白酶接触。
19.根据权利要求16所述的方法,其中所述至少一种蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、ArgC、LysC、LysN、胃蛋白酶或其任何组合。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法,其中所述分析包括对跨不同级分的来自重链和轻链的肽丰度或肽特征强度进行定量,并且其中所述确定所述抗体或抗体片段的重链和轻链配对基于跨所述不同级分的来自所述重链和所述轻链的肽的量。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其进一步包括确定所述混合物中存在的所述抗体或抗体片段的所述轻链和所述重链的至少一部分的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述轻链和所述重链的所述部分是互补决定区3(CDR3)。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法,其中所述分析所述抗体或抗体片段肽的步骤包括使所述抗体或抗体片段肽经受质谱法(MS)以及使用串联MS(MS/MS)对所述肽进行测序,由此获得MS/MS谱。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述MS是液相色谱法-MS(LC-MS),并且所述MS/MS是串联MS/MS。
25.根据权利要求23或24所述的方法,其中将所述MS/MS谱与抗体肽序列的数据库进行比较,或与如根据权利要求21或22所确定的所述混合物中存在的所述抗体或抗体片段的所述轻链和所述重链的至少一部分的序列进行比较。
26.根据条款1至25中任一项所述的方法,其中所述分析所述抗体或抗体片段肽的步骤包括对每个重链和轻链所特有的蛋白特征性肽进行定量分析,以及基于相同级分中的所述蛋白特征性肽的共表达进行配对。
27.根据条款1至25中任一项所述的方法,其中所述分析所述抗体或抗体片段肽的步骤包括进行聚类分析。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于确定抗体和/或抗体片段混合物中的抗体或抗体片段的重链和轻链配对的方法,所述方法包括:(a)使所述混合物在非还原条件下经受分离步骤,以获得分离的抗体或抗体片段的级分;(b)消化所述级分中的所述分离的抗体或抗体片段,以获得抗体或抗体片段肽;(c)分析所述抗体或抗体片段肽;以及(d)基于所述分析确定所述抗体或抗体片段的重链和轻链配对。
2.一种用于确定抗体和/或抗体片段混合物中的抗体或抗体片段的重链和轻链配对的方法,所述方法包括:(i)使所述混合物与交联剂接触,以获得交联的抗体或抗体片段;(ii)消化所述交联的抗体或抗体片段,以获得交联的抗体或抗体片段肽;(iii)分析所述交联的抗体或抗体片段肽;以及(iv)基于所述分析确定所述抗体或抗体片段的重链和轻链配对。
3.根据权利要求1所述的方法,其中在非还原条件下的所述分离步骤包括使所述抗体和/或抗体片段混合物经受色谱法。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述色谱法是疏水相互作用色谱法(hic)。
5.根据权利要求1所述的方法,其中在非还原条件下的所述分离步骤包括在凝胶上迁移所述抗体和/或抗体片段混合物。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述凝胶是聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其中所述凝胶是天然凝胶。
8.根据权利要求5或6所述的方法,其中所述凝胶是变性2d凝胶。
9.根据权利要求1所述的方法,其中在非还原条件下的所述分离步骤包括使所述抗体和/或抗体片段混合物经受毛细管电泳法。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述毛细管电泳法是成像毛细管等电聚焦(icief)。
11.根据权利要求1和3至10中任一项所述的方法,其进一步包括使所述抗体和/或抗体片段混合物与以序列特异性方式使蛋白质分子的电荷改性的药剂接触。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述药剂使带正电的残基改性为中性或带负电的基团。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述药剂是柠康酸酐(ca)或磺基-nhs-乙酸酯(sna)。
14.根据权利要求2所述的方法,其中所述交联剂包括两个n-羟基磺基琥珀酰亚胺(nhs)酯基。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述交联剂是二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(bs3)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括在所述消化之前使半胱氨酸残基还原和烷基化。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述抗体和/或抗体片段混合...
【专利技术属性】
技术研发人员:蒂埃里·勒比汉,特雷莎·努涅斯·德比利亚维森西奥·迪亚兹,玛丽亚·利亚索瓦,姚晨禹,刘启新,切尔西·赖策尔,段锦,保罗·泰勒,马斌,
申请(专利权)人:快速诺凡公司,
类型:发明
国别省市:
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