【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及一种基于蛋白质标签自组装的固定化羰基还原酶及其在连续催化3,5-双三氟甲基苯乙酮不对称还原制备阿瑞吡坦中间体(r)-3,5-双三氟甲基苯乙醇中的应用。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、阿瑞吡坦为神经激肽1受体拮抗剂，可用做肿瘤病人化疗过程中的镇吐和止吐药物。(r)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇是合成阿瑞吡坦药物的关键手性中间体，目前不对称合成(r)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的方法主要有化学法和生物法，其中，生物催化制备法因具有选择性高，反应条件温和，环境友好等优势，在不对称合成(r)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇方面具有重要的应用价值。酶作为一类重要的生物催化剂，是实现高效生物催化的关键。然而，利用游离酶催化时，酶的催化活性和酶稳定性易受到反应条件的影响，且酶的重复使用性能通常也不理想，这不仅降低了酶催化反应的效率，同时也由于反应体系中残存的酶使得后续的产物分离纯化过程变得复杂。利用固定化酶进行生物催化，特别是近年来出现的新型酶固定化策略可很好地改善酶的性能，克服上述缺陷，明显提高酶催化的反应效率，并实现酶的重复使用。
2、传统的酶固定化技术多通过物理或化学方法，将游离酶结合于载体上或束缚于一定的空间范围内用于生物催化反应，例如包埋法，吸附法，交联法和共价结合法等。上述方法的酶固定化制备过程较为复杂，且固定化过程中酶容易失活，酶稳定性和重复使用性能也存在一定的局限性。
3、近年来，通过蛋白质自组装标签形成的纳米颗粒已成功应用于蛋白纯化，药物递送和酶固定化等多个领域。蛋
4、通过连续流方式进行生物催化近年来受到人们的关注，然而目前的研究还仅限于酯酶等不涉及辅因子的酶催化反应过程。对于反应过程中需要nad(p)h、磷酸吡哆醛(plp)、fad等辅因子的复杂酶催化反应，由于在连续流酶催化反应时nad(p)h、plp、fad等昂贵辅因子因其流动性而往往不易回收，这也阻碍了反应过程中涉及辅因子的复杂酶在连续流催化模式中的应用。因此，利用nad(p)h依赖性羰基还原酶实现连续流催化时辅因子再生对产率的影响至关重要。
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种基于蛋白质标签自组装的无载体固定化羰基还原酶及其在不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(r)-3,5-双三氟甲基苯乙醇中的应用。本专利技术首先通过筛选不同的刚性或柔性连接肽，得到合适的连接肽，随之将自组装标签与实验室自行筛选的雷弗松氏菌来源羰基还原酶连接，构建得到无载体固定化羰基还原酶，不仅省去了酶固定化载体的使用，且有效提高了羰基还原酶的稳定性、酶催化活性和底物耐受性，延长了酶的半衰期，增加了酶的重复使用批次；此外，本专利技术将所述制备得到的固定化羰基还原酶冻干酶粉填入层析柱中进行连续流酶催化制备(r)-3,5-双三氟甲基苯乙醇，可实现2m的3,5-双三氟甲基苯乙酮的高底物浓度转化以及对辅因子nad(p)h的高效利用，辅因子的总转化数(ttn值)达4816，有效解决了连续流反应过程中辅因子的流失问题，可大大降低应用连续流酶催化时因辅因子过度流失导致的催化成本提高，并显著提高了酶催化效率。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种基于蛋白质标签自组装的无载体固定化羰基还原酶，所述基于蛋白质标签自组装的无载体固定化羰基还原酶是将融合羰基还原酶的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体通过超声破碎，将破碎液经离心后所得沉淀用含0.5-2％(v/v)triton x-100的pb缓冲液(ph 6.0)洗涤(优选洗涤三次)，随后再用纯pb缓冲液洗涤(优选洗涤一次)后重悬于pb缓冲液中，即得固定化羰基还原酶酶液；所述融合羰基还原酶是将源自雷弗松氏菌的seq id no.2所示羰基还原酶lxcar-s154y基因编码蛋白的n端通过连接肽与seq idno.3所示cipa基因编码蛋白的c端连接构成。
4、进一步，所述连接肽氨基酸序列为：ggggsggggs。
5、进一步，所述融合羰基还原酶的基因工程菌按如下步骤构建：采用重叠延伸pcr方法，分别扩增雷弗松氏菌来源的羰基还原酶lxcar-s154y基因(编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示)与cipa基因(编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示)，使得cipa序列的c端与lxcar-s154y的n端分别带有连接肽；随后，以上述两段基因作为模板，运用无缝克隆技术扩增出完整的融合蛋白基因cipa-linker-lxcar-s154y，将其插入到pet28a载体的nco i与hindⅲ之间，构建重组质粒pet28a(+)-cipa-linker-lxcar-s154y；采用热激法将重组质粒pet28a(+)-cipa-linker-lxcar-s154y转入e.coli dh5α中，随后涂布至含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上，37℃培养12h；随机挑取生长良好的单克隆菌株接种至lb液体培养基中，37℃，180rpm培养12h，以sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取培养菌液中的重组质粒，热激法转化e.coli bl21(de3)，构建重组基因工程菌e.coli bl21(de3)-pet28a(+)-cipa-linker-lxcar-s154y。
6、进一步，所述固定化羰基还原酶酶液按如下步骤制备：将融合羰基还原酶的基因工程菌接种于lb液体培养基中，37℃、180rpm培养12h后获得种子培养液，以体积浓度1％比例吸取种子培养液加至新鲜的lb液体培养基中，37℃、200rpm培养至od600为0.6-0.8；随后，在液体培养基中加入0.1-0.8mm(优选0.5mm)的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，30℃、200rpm培养1-20h(优选10h)以诱导蛋白表达；培养后的菌液经9000rpm，4℃，离心10min后，所得湿菌体用pb缓冲液重悬(优选100mm、ph 6.0的pb缓冲液，湿菌体加入量为0.05g/ml)，随后于冰浴条件下通过超声破碎裂解细胞(360w、超声2s间歇5s，共超声40min)；破碎液经9000g，4℃离心10min后，所得沉淀用含体积浓度0.5-2％(优选1％)triton x-100的pb缓冲液(ph 6.0)洗涤三次，继而用纯pb缓冲液洗涤一次，随后重悬于与超声破碎时所用体积相同pb缓冲液中，即得固定化羰基还原酶酶液。
7、本专利技术还提供一种所述固定化羰基还原酶在催化潜手性酮不对称还原制备阿瑞吡坦中间体中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于蛋白质标签自组装的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述固定化羰基还原酶是将融合羰基还原酶的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎，破碎液经离心后所得沉淀用含体积浓度0.5-2％Triton X-100的PB缓冲液洗涤，随后用PB缓冲液洗涤并重悬于PB缓冲液中，即为固定化羰基还原酶酶液；所述融合羰基还原酶是将源自雷弗松氏菌的SEQ ID NO.2所示LXCAR-S154Y基因编码蛋白的N端通过连接肽与SEQ ID NO.3所示CipA基因编码蛋白的C端连接构成。
2.如权利要求1所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述连接肽氨基酸序列为：GGGGSGGGGS。
3.如权利要求1所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述固定化羰基还原酶酶液按如下步骤制备：将融合羰基还原酶的基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm培养12h后，以体积浓度1％比例取菌液加入LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8；随后，加入0.1-0.8mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并于30℃、200rpm培养1-20h以诱导蛋白表达；
4.如权利要求3所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，超声破碎条件为：功率360W、超声2s间歇5s，共超声40min。
5.一种权利要求1所述固定化羰基还原酶在制备阿瑞吡坦中间体中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以所述固定化羰基还原酶为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，以NADH为辅酶，以异丙醇为辅助底物和助溶剂，以pH 6.0-8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-55℃、150-300rpm条件下进行催化反应，反应液经分离纯化后获得(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇产物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂用量以蛋白含量计为0.05～1mg/mL；底物初始加入浓度为10～2000mM；所述NADH加入终浓度为0.5～3mM；所述异丙醇体积加入量为20-70％。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的催化应用采用层析柱为反应器进行连续流酶催化反应，将所述固定化羰基还原酶加入层析柱中，再将底物溶液经循环泵连续泵入层析柱中直至底物被完全催化，反应结束后，反应液经分离纯化，获得(R)-3，5-双三氟甲基苯乙醇产物；所述底物溶液组成：0.5-3mM NADH、体积浓度20-70％异丙醇、10～2000mM3,5-双三氟甲基苯乙酮，溶剂为PB缓冲液；所述底物溶液通入的速度为2-6mL/min；所述固定化羰基还原酶装填量以层析柱容积计为0.5-1.5g/L。
9.一种用于固定化羰基还原酶制备阿瑞吡坦中间体的连续流催化与萃取偶联反应装置，其特征在于，所述连续流催化与萃取偶联反应装置包括层析柱1、萃取器6、蠕动泵11、循环泵12、萃取剂容器9、收集器10、底物溶液储罐13；所述萃取器6为侧壁带有出气口7的分液漏斗，所述分液漏斗顶部配有活塞5，底部设有用于控制出液口的旋塞8；所述活塞5顶端设有第一进液管3和第二进液管4，第一进液管3与第二进液管4在活塞内部交汇成一个通道并向下延伸，交汇处高度至少低于两处进液管高度1cm，延伸长度短于分液漏斗高度；所述底物溶液储罐13为三口烧瓶，设置取样口14；所述层析柱1的顶端通过硅胶管与三通阀2相连，同时三通阀2通过硅胶管与循环泵12连接，所述循环泵12与底物溶液储罐13连接，所述底物溶液储罐13与层析柱1的底端连接形成反应通路；所述萃取器6的出液口与收集器10连通，所述萃取器6顶端的第一进液管3通过硅胶管与蠕动泵11连接，所述蠕动泵11通过硅胶管与萃取剂容器9连接，萃取剂通过蠕动泵泵入分液漏斗；所述第二进液管4通过硅胶管与三通阀2相连形成萃取通路。
10.如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述连续流催化与萃取偶联反应装置具操作方法为：将底物溶液加入底物溶液储罐13，萃取剂加入萃取剂容器9，反应开始时，将三通阀门2与循环泵12连通，关闭三通阀门2与萃取器6第二进液口4的连接，底物溶液从底物溶液储罐13通过循环泵12经三通阀2从顶部进入层析柱1中，反应液回到底物溶液储罐13再进入循环泵12形成循环的反应通路；从底物溶液储罐13的取样口14取样检测反应结束后，将三通阀门2与萃取器6的第二进液口4连通而关闭三通阀门2...
【技术特征摘要】
1.一种基于蛋白质标签自组装的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述固定化羰基还原酶是将融合羰基还原酶的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎，破碎液经离心后所得沉淀用含体积浓度0.5-2％triton x-100的pb缓冲液洗涤，随后用pb缓冲液洗涤并重悬于pb缓冲液中，即为固定化羰基还原酶酶液；所述融合羰基还原酶是将源自雷弗松氏菌的seq id no.2所示lxcar-s154y基因编码蛋白的n端通过连接肽与seq id no.3所示cipa基因编码蛋白的c端连接构成。
2.如权利要求1所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述连接肽氨基酸序列为：ggggsggggs。
3.如权利要求1所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述固定化羰基还原酶酶液按如下步骤制备：将融合羰基还原酶的基因工程菌接种于lb液体培养基中，37℃、180rpm培养12h后，以体积浓度1％比例取菌液加入lb液体培养基中，37℃、200rpm培养至od600为0.6-0.8；随后，加入0.1-0.8mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，并于30℃、200rpm培养1-20h以诱导蛋白表达；培养后的菌液经离心分离，湿菌体用pb缓冲液重悬，随后在冰浴条件下通过超声破碎裂解细胞；破碎液经离心，沉淀用含有体积浓度0.5-2％triton x-100的pb缓冲液洗涤三次，随后用纯pb缓冲液洗涤一次，最后重悬于pb缓冲液中，即为固定化羰基还原酶酶液。
4.如权利要求3所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，超声破碎条件为：功率360w、超声2s间歇5s，共超声40min。
5.一种权利要求1所述固定化羰基还原酶在制备阿瑞吡坦中间体中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以所述固定化羰基还原酶为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，以nadh为辅酶，以异丙醇为辅助底物和助溶剂，以ph 6.0-8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-55℃、150-300rpm条件下进行催化反应，反应液经分离纯化后获得(r)-3,5-双三氟甲基苯乙醇产物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂用量以蛋白含量计为0.05～1mg/ml；底物初始加入浓度为10～2000mm；所述nadh加入终浓度为0.5～3mm；所述异丙醇体积加入量为20-70％。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的催化应用采用层析柱为反应器进行连续流酶催化反应，将所述固定化羰基还原酶加入层析柱中，再将底物溶液经循环泵连续泵入层析柱中...
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