【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生命科学，尤其是指一种负载kpt-330的牛奶外泌体及其制备方法与应用。
技术介绍
1、弥漫大b细胞淋巴瘤(diffuse large b-cell lymphoma,dlbcl)是一种主要来源于淋巴结生发中心的成熟b淋巴细胞侵袭性淋巴瘤，是成人nhl最常见的类型，约占30％～40％。dlbcl在临床和生物学方面存在着很大的异质性。自从利妥昔单抗与以往标准chop化疗方案联合使用后，dlbcl患者的生存率明显提高，但仍有部分患者出现复发和耐药，其预后很差。因此，寻找新的治疗dlbcl有效的补充或替代药物具有重要意义。
2、塞利尼索selinexor(kpt-330)是一种新型的口服选择性核输出抑制剂，在大量预处理的r/r dlbcl和其他血液及实体恶性肿瘤中具有重要的活性。seline-xor(kpt-330)是一种高度特异性的xpo1/crm1小分子抑制剂，通过形成一个缓慢可逆的共价键与xpo1货物结合袋中的cys-528残基反应位点结合，导致主要肿瘤抑制蛋白的核保留增加和癌细胞的选择性凋亡。xp o1参与调节多种癌蛋白的信使rna转录物的细胞质水平，如c-myc,bcl-2，xp-o1表达增加在几乎所有恶性肿瘤中都被发现，并与侵袭性、预后差的疾病相关。但kpt-330在临床应用中最常见的不良反应有厌食、恶心呕吐和低钠血症以及血液学毒性等。
3、外泌体是由多种细胞类型分泌的纳米级囊泡，直径在30-150nm，具有脂质双层膜结构，透射电镜下呈双凹碟形或杯状。外泌体几乎存在于所有体液中，如血液
4、目前使用外泌体运输药物的类型主要有三类：1.小分子化学药物，如抗肿瘤药物紫杉醇、阿霉素、姜黄素等；2.核酸类药物，如dna、mrna、sirna、非编码rna：microrna、lncrna、circrna等；3.蛋白质类药物，如抗原等。外泌体作为药物载体具有免疫原性低，可穿生物屏障，亲和力高，能逃避溶酶体吞噬清除，具有高度的生物兼容性及低毒性等明显优势。
5、因此，有必要以牛奶外泌体为载体负载kpt-330，研究其在弥漫大b细胞淋巴瘤中的治疗应用。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种负载kpt-330的牛奶外泌体及其制备方法与应用，具体为一种负载kpt-330的牛奶外泌体及其制备方法与其在制备治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物中的应用。本专利技术从牛奶中分离纯化外泌体，并用牛奶外泌体负载kpt-330。与单独使用kpt-330相比，负载kpt-330的外泌体对弥漫大b细胞淋巴瘤细胞有相同的增殖抑制作用，同时可以延缓药物释放，增加循环时间；且在小鼠荷瘤实验中抗肿瘤的同时有效减轻kpt-330引起的小肠淋巴细胞浸润、绒毛间质水肿以及炎症因子lps、il-12的产生，具有改善kpt-330治疗应用中胃肠道副反应的优势。为临床治疗弥漫大b细胞淋巴瘤提供了一种新的给药方式。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术第一个目的是提供一种负载kpt-330的牛奶外泌体，包括牛奶外泌体以及负载于牛奶外泌体上的kpt-330；所述牛奶外泌体与kpt-330的质量比为1：1-1：4。
4、在本专利技术的一个实施例中，所述牛奶外泌体的粒径为30nm-150nm；优选为30nm-100nm。
5、在本专利技术的一个实施例中，所述负载kpt-330的外泌体的分子量≥50kd。
6、本专利技术第二个目的是提供一种负载kpt-330的牛奶外泌体的制备方法，包括以下步骤：
7、将牛奶外泌体与kpt-330混合孵育，加入缓冲液后进行超滤，得到所述负载kpt-330的牛奶外泌体。
8、在本专利技术的一个实施例中，所述牛奶外泌体采用差速离心法从脱脂牛奶中分离纯化得到。
9、在本专利技术的一个实施例中，所述kpt-330的浓度为20μm-100μm。
10、在本专利技术的一个实施例中，所述孵育的条件为：20μm-40μm孵育12h-48h。
11、在本专利技术的一个实施例中，所述缓冲液为pbs缓冲液和/或hanks缓冲液。
12、在本专利技术的一个实施例中，所述超滤的条件为：1500rpm-3000rpm超滤10min-60min。
13、本专利技术第三个目的是提供所述负载kpt-330的牛奶外泌体在制备治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物中的应用。
14、在本专利技术的一个实施例中，所述应用的方法包括以下步骤：
15、(1)负载kpt-330的牛奶外泌体的抗肿瘤作用：体外比较kpt-330包载前后的dlbcl细胞杀伤作用；小鼠体内荷瘤实验中比较肿瘤增殖抑制效果；具体步骤为：对dlbcl细胞的杀伤作用具体步骤为将细胞以每孔10×104的密度铺入96孔板，将kpt-330和exo-kpt-330按照浓度梯度100μm、50μm、10μm、1μm、0.1μm、0.01μm、0.001μm稀释加入细胞中，48h后加cck-8检测药物对细胞的杀伤作用；建立nod-scid皮下肿瘤模型，成瘤后分组分别给予羧甲基纤维素钠、纯外泌体、kpt-330、exo-kpt-330治疗，治疗结束后比较肿瘤体积的变化。
16、(2)负载kpt-330的牛奶外泌体对于胃肠道的保护作用：探究kpt-330包载前后对于小鼠小肠上皮细胞mode-k的损伤情况；在体内观察小肠绒毛炎症及血清中炎症因子释放情况；具体步骤为：将小鼠小肠上皮细胞mode-k以每孔1×104密度铺入96孔板，将包载前后的药物按2、5μm的浓度加入细胞中，24h后检测药物对mode-k细胞的杀伤；小鼠荷瘤实验结束后取小鼠小肠做he染色，比较不同组别治疗后小肠部位的炎症情况，收集小鼠血清，检测炎症因子lps和il-12的释放。
17、(3)kpt-330包载前后跨肠上皮转运情况：体外构建caco-2单层细胞模拟肠上皮屏障以探究kpt-330的跨上皮转运。具体步骤为：在transwell小室聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种负载KPT-330的牛奶外泌体，其特征在于，包括牛奶外泌体以及负载于牛奶外泌体上的KPT-330；所述牛奶外泌体与KPT-330的质量比为1：1-1：4。
2.根据权利要求1所述的牛奶外泌体，其特征在于，所述牛奶外泌体的粒径为30nm-150nm。
3.根据权利要求1所述的牛奶外泌体，其特征在于，所述负载KPT-330的外泌体的分子量≥50KD。
4.一种负载KPT-330的牛奶外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述牛奶外泌体采用差速离心法从脱脂牛奶中分离纯化得到。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述KPT-330的浓度为20μM-100μM。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的条件为：20μM-40μM孵育12h-48h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液和/或Hanks缓冲液。
9.权利要求1-3任一项所述负载KPT-330的牛奶外泌体在制备
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物中负载KPT-330的牛奶外泌体的浓度为0.001μM-100μM。
...【技术特征摘要】
1.一种负载kpt-330的牛奶外泌体，其特征在于，包括牛奶外泌体以及负载于牛奶外泌体上的kpt-330；所述牛奶外泌体与kpt-330的质量比为1：1-1：4。
2.根据权利要求1所述的牛奶外泌体，其特征在于，所述牛奶外泌体的粒径为30nm-150nm。
3.根据权利要求1所述的牛奶外泌体，其特征在于，所述负载kpt-330的外泌体的分子量≥50kd。
4.一种负载kpt-330的牛奶外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述牛奶外泌体采用差速离心法从脱脂牛奶中分离纯化得到...
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