一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法和用途，其特征是将基因重组方法得到的Ａβ多肽的单体用无水二甲基亚砜溶解后，置于缓冲体系中反应，使其自然聚合形成寡聚体。本发明专利技术提供的基因重组得到单体的方法经济、环保；以Ａβ为原料在体外组装淀粉样肽寡聚体时，通过模拟体内生理条件，改良人工脑脊液组成，所得产物稳定均一。本方法制备的寡聚体可以作为多种阿尔茨海默病检测和治疗研究的标准参照物，在制备阿尔茨海默病诊断试剂和治疗药物中获得应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法。本专利技术还涉及所 述寡聚体在制备阿尔茨海默病的诊断试剂和治疗药物中的应用。
技术介绍
淀粉样肽寡聚体(亦称为Αβ寡聚体)被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)早期病理改变的始动因素。最新研究表明，只有低分子量A β寡聚体才是引 起AD神经元损伤的毒性物质，高分子量聚集物和纤维成分不具有这种作用。在人体外人工 制备该淀粉样肽寡聚体，有助于研究阿尔茨海默病的致病机理和治疗方法。淀粉样肽在体外容易形成包含纤维和不具有纤维形态的高分子量或低分子量聚 集物在内的混合物。这种组分不均一的混合物影响研究的准确性和可靠性。因此，获得稳 定均一的低分子量Αβ寡聚体对科研工作非常重要。众多学者曾采用多种方法制备Αβ寡聚体，但收率和效果比较低，并且所得Αβ寡 聚体的成分不均一，含有较多成分的高分子量聚集物和纤维状成分，难以进一步提纯。如， 利用化学交联法制备的寡聚体在成分上有差异，不能真实反应低分子量A β寡聚体的作用 特点。而且各制备方法的条件不稳定，所得结果难以比较。有些方法和材料具有较大的不 良反应，影响试验者和应用者的健康。因此，研制一种新型人工体外淀粉样肽寡聚体制备方法，获得均一可溶性低分子 量的淀粉样肽寡聚体，确有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低分子量淀粉样肽寡聚体的制备方法，直接目的是提供 均一分子量的淀粉样肽寡聚体，具有特征性的超微形态和二级结构，可用于制备阿尔茨海 默病的诊断试剂和治疗药物。本专利技术的技术方案如下一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法，其特征是将A β多肽的单 体用无水二甲基亚砜溶解后，于4°C置于缓冲体系中反应22 26小时，使其自然聚合形 成寡聚体；所述缓冲体系组成是NaCl 125mmol/L, KCl 3. 3mmol/L, KH2PO4 1. 2mmol/L, NaHC0326mmol/L, CaCl2 2. 5mmol/L, MgS04 2. 4mmol/L，葡萄糖 5mmol/L，氨基酸 0. 3g/L。所述淀粉样肽特指由其前体蛋白APP(amyloid precourcer protein)经过蛋白酶 降解形成的表观分子量为4kD的多肽；本专利技术所用的缓冲体系是改良的人工脑脊液，在传统人工脑脊液的基础上调整了 葡萄糖和氨基酸含量，其改良后的组成接近于正常脑脊液，有利于模拟体内生理条件。最佳反应时间为24小时。所得寡聚体是在透射电镜下观察为直径IOOnm以下的球形颗粒物，分子量为16 40kD。3所述Αβ多肽的单体可以用传统的化学合成方法制备，如，以Αβ 42为原料，通过 六氟异丙醇(l，l，l，3，3，3-hexafluoro-2-propannol，HFIP)的作用使其单体化。所述A β 42基因序列是已知的，Genebank登录号BC065529 ；本专利技术提供了一种用基因重组的方法得到淀粉样肽单体，更为经济和环保，所得 到的淀粉样肽单体质量更好，方法是在N端加组氨酸标签(6XHis)，C端加终止子序列 TGA,构建A β 42单体表达载体，按照常规方法在大肠杆菌表达体系内表达，用Ni柱纯化目 的多肽。然后于室温下将A β 42单体溶于冰预冷1 2h的六氟异丙醇，通过送风挥发，完 全除去六氟异丙醇，形成肽膜。本专利技术所制备的人工体外淀粉样肽寡聚体在电子显微镜下分析，可以看到纳米级 的微粒。利用圆二色谱(Circular dichroism,⑶)法分析其二级结构，可以检测到特征性 的寡聚体负峰。利用蛋白免疫印迹的方法可以验证制备出分子量在16. 5kD范围内的Αβ寡聚体。本研究首先构建了 Αβ单体的原核表达杂载体，诱导表达并且纯化后，通过HFIP 将其单体化，用蛋白免疫印迹的方法验证获得了所需的单体。本专利技术对制备的人工体外淀粉样肽寡聚体进行了如下实验1、免疫印迹(Western blot)实验目的验证所得寡聚体是成分均一的，并且具有免疫反应性。结果显示所得寡聚体能够被抗人Αβ单克隆抗体6Ε10特异性识别，并且在 16. 5kD左右的范围内有均一条带(见实施例3)。说明所得寡聚体是低分子量的均一成分， 并且具有免疫反应性。用于蛋白质免疫印迹的最佳淀粉样肽寡聚体样品质量为5 μ g/孔。2、透射电镜检测目的验证所得寡聚体是纳米级的均一微粒。结果显示在透射电镜下观察到5nm到IOnm左右的球形寡聚体，随着聚集过程，出 现颗粒状以及20-30nm的卷曲结构和丝状或分枝状的纤维(见实施例4)。说明所得寡聚体 具有特征性的超微结构。3、圆二色谱检测目的验证所得寡聚体具有特征性的二级结构。结果显示聚集过程中α螺旋向β折叠转变(见实施例5)。说明所得寡聚体获 得了特征性的二级结构。用本专利技术获得的淀粉样肽寡聚体可以制备出诊断、预防和治疗阿尔茨海默病的药 物、试剂等。例如，可以采用基因工程方法，构建和/或表达多种小分子基因工程疫苗、多肽疫 苗，以便用于AD预防和早期治疗的基础与临床研究和应用。本专利技术人以所获得的淀粉样肽寡聚体作为标准品，利用夹心ELISA法(酶联免疫 吸附试验)^Western blot实验、透射电镜和CD等实验方法，分别制备出了四种不同方法的 检测阿尔茨海默病的试剂。本专利技术的优点首先，本专利技术模拟体内生理条件，以Αβ为原料在体外组装淀粉样肽寡聚体，所得4产物稳定均一。这一点优于其它“化学交联”法的效果。其次，本专利技术优化了制备中的关键参数，所得产物可以作为多种AD检测和治疗研 究的标准参照物。确定了获得Αβ单体的最佳方法、改良人工脑脊液组成、确定关键时间点 为 24h。第三，用基因重组方法得到单体的好处是，经济、环保、基因能够在体外扩增和表 达，可再生性强。附图说明图1为Western blot实验验证单体的获得。单体条带位于6. 5kD下方附近约4kD 的位置。图2为Western blot实验验证淀粉样肽寡聚体形成的结果。图中1为淀粉样肽 的单体；图中2为淀粉样肽的寡聚体，条带位于16. 5kD下方位置。图3为透射电镜下淀粉样肽寡聚体的形态特征。A.只有寡聚体形成，没有纤维状 或分枝状的结构；B.有大量纤维形成。图4圆二色谱检测淀粉样肽寡聚体二级结构特征(于24h时可见明显的负峰)。 具体实施例方式实施例1淀粉样肽单体的获得1、基因重组法Αβ 42基因(Genebank登录号BC065529)委托上海生工生物工程技术服务有限 公司合成，并安装在带有6XHis标签的原核表达载体上组成NAbeB-pET30a表达质粒。然 后转化大肠杆菌BL21，进行诱导表达。取NAbeB-pET30a-BL21冻存菌液，在Kana抗性的 LB培养板上划线，37°C培养12 16h ；挑取生长良好的单菌落到7ml具有Kana抗性的LB 培养液中，260rpm，37°C过夜培养；大约培养4h后菌液OD值达到0. 6，此时加入终浓度为 lmmol/1的IPTG进行诱导，6h后12000rpm，4°C离心15min收集菌体；用PBS洗涤菌体两次， 12000rpm，4°C离心15min收集菌体；每500ml菌液收集的菌体中加入30ml裂解液重悬细 菌，充分混和，300w，工作10s，间歇1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法，其特征是将Ａβ多肽的单体用无水二甲基亚砜溶解后，于４℃置于缓冲体系中反应２２～２６小时，使其自然聚合形成寡聚体；所述缓冲体系组成是：ＮａＣｌ １２５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣｌ ３．３ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］ １．２ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮａＨＣＯ↓［３］ ２６ｍｍｏｌ／Ｌ，ＣａＣｌ２ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ ２．４ｍｍｏｌ／Ｌ，葡萄糖５ｍｍｏｌ／Ｌ，氨基酸０．３ｇ／Ｌ。
【技术特征摘要】
一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法，其特征是将Aβ多肽的单体用无水二甲基亚砜溶解后，于4℃置于缓冲体系中反应22～26小时，使其自然聚合形成寡聚体；所述缓冲体系组成是NaCl 125mmol/L，KCl 3.3mmol/L，KH2PO4 1.2mmol/L，NaHCO3 26mmol/L，CaCl2 2.5mmol/L，MgSO4 2.4mmol/L，葡萄糖5mmol/L，氨基酸0.3g/L。2.权利要求1所述的方法，所述Aβ多肽的单体是用基因重组的方法得到淀粉样肽单体。3.权利要求1所述的方法，反应时间为24小时。4.权利要求1或2所述的方法，所得的寡聚体是在透射电镜下观察直径IOOnm以下的 球形颗粒物，分子量为16 40kD。5.一种基因重组制备Αβ多肽的单体的方法，在N端加组氨酸标签组6XHis，C端加 终止子序列TGA，构建A β ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张莹，洪涛，彭向雷，
申请(专利权)人：北京交通大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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