【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体而言，涉及一种荧光-电子显微镜联用对微生物进行鉴定及矿化分析的方法。
技术介绍
1、微生物是地球上出现最早、种类和数目最多、功能最全的一种生命形式。通过矿化作用，微生物直接参与地球上至少六十余种矿物的形成和转化。研究“微生物-矿物”相互作用对认识现今和地质历史时期的地球元素的生物化学循环、地球早期生命起源与演化及环境变迀，以及利用微生物开展环境修复和生物仿生等纳米地球科学应用具有重要意义。
2、自然界中能够矿化的微生物及微生物形成的矿物极其丰富多样。目前，微生物学家多采用核糖体基因(rdna)对微生物进行系统分类。例如，16s rdna是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大(约占细菌dna含量的80％)，分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。研究中，人们通常采用基因扩增和测序技术获得自然环境中未培养微生物rdna序列(例如16s rdna，18s rdna和23s rdna等)的多样性，针对每条rdna序列的保守性和可变性，设计其特异性、带荧光标记的寡核苷酸链探针，借助荧光原位杂交技术(fish)和荧光显微镜观察，可以将含有该条rdna序列的微生物鉴定出来，从而实现微生物系统发育多样性研究及其鉴定。然而，常规的荧光显微镜依靠激光作为光源，其分辨率只能达到微米或亚微米(～0.2μm)，只能观察被荧光染料标记微生物的大致形貌，缺乏被染料标记微生物内部的亚细胞结构信息，也不能在纳米以及原子水平获得微
3、电子显微镜(包括扫描电镜和透射电镜)采用高压电子束作为电子源，能在微米到纳米甚至原子水平上获取试样的形貌、结构和成分等信息。受制于学科和研究方法分割的限制，传统研究多将微生物的荧光显微镜和电子显微镜研究分离，使得人们对环境中(特别是海洋和一些极端环境)大量存在的未培养微生物的种类(系统发育)及其生物矿化过程之间的对应关系缺乏系统认识。
4、趋磁细菌是迄今发现的唯一能利用地磁场定向和在细胞内矿化合成纳米级磁铁矿(fe3o4)或胶黄铁矿(fe3s4)的原核微生物，是研究微生物控制矿化和微生物-矿物相互作用的典范。研究发现，趋磁细菌具有全球分布，其细胞种类(系统发育)和磁小体晶型均具有丰富的多样性，表明其生物矿化机制也可能多样。针对未培养趋磁细菌，前人多采用不依赖纯培养的分子生态学(16s rdna序列测定)研究其系统发育，采用透射电镜技术研究磁小体的形貌、尺寸、结构、成分和细胞内的组装结构等性质，从而认识趋磁细菌的生物矿化过程和机理。
技术实现思路
1、本专利技术以趋磁细菌为例，建立一种荧光和电子显微镜联用技术，实现了对一个趋磁细菌细胞在单细胞水平上的种类鉴定(系统发育)和在纳米尺度上的生物矿化研究(细胞和矿物形貌结构等)。该专利技术为系统开展环境中未培养趋磁细菌和其他类型矿化微生物的种类鉴定、多样性研究和矿化过程和机理研究提供了一条简单易行的新途径。
2、本专利技术涉及一种荧光显微镜和电子显微镜联用，对微生物细胞同时进行种类鉴定和生物矿化分析的方法。
3、所述的方法包括如下步骤：
4、(1)微生物细胞样本的收集、细胞固定和rdna序列测定；
5、(2)特异性寡核苷酸探针设计、合成和检测；
6、(3)固相荧光原位杂交、荧光显微镜和扫描电镜(sem)联用检测微生物细胞样本；
7、或(4)液相荧光原位杂交、荧光显微镜和透射电镜(tem)联用检测微生物细胞样本。
8、所述的联用指同一样本上的同一微生物细胞经过荧光显微镜观察后，再使用电子显微镜观察。
9、所述的微生物细胞是自然界未培养或实验室可培养的各种能够进行生物矿化的生物，
10、所述的生物矿化是指能在细胞内、细胞周质空间或细胞外合成各种无机或有机矿物质。
11、所述的微生物细胞优选为趋磁细菌、蓝细菌、铁氧化细菌、铁还原细菌、硫酸盐还原细菌或单细胞硅藻，最优选为趋磁细菌。
12、可通过常规的基因扩增和测序技术，获得这些微生物的rdna序列，针对它们rdna序列的保守性和可变性，设计其特异性、带荧光标记的寡核苷酸链探针。
13、所述的种类鉴定是指通过改进的荧光原位杂交技术(fish)，鉴定微生物的种属。
14、所述的改进的荧光原位杂交技术是指，将经特异性、带荧光标记的寡核苷酸链探针杂交后的微生物细胞固定在盖玻片或透射电镜专用碳支持膜铜网上，借助荧光显微镜将含有可被所述寡核苷酸链探针识别的rdna序列的微生物标记出来。
15、所述的生物矿化分析是指，对微生物细胞及其合成的矿物在纳米尺度到原子水平上进行的形貌、结构、成分分析和矿物相的分析。
16、所述的荧光显微镜包括可观测荧光标记物的普通光学显微镜、激光共聚焦显微镜等。
17、步骤(1)所述的细胞固定方法为：
18、1)采用蒸馏水离心洗涤三次细胞，悬浮在75μl pbs缓冲液中(缓冲液用0.22μm滤膜过滤除菌)；
19、2)加入25μl 4％的多聚甲醛溶液(终浓度为1％)，4℃下固定3-12h后，离心去上清；
20、3)将固定后的细菌重新悬浮在200μl pbs缓冲液中，最后加入200μl无水乙醇，混匀-20℃放置备用。
21、步骤(1)所述的rdna序列测定为：取部分细胞直接用来进行rdna基因扩增和测序，获取目标样品中这些微生物细胞基于rdna序列的系统发育信息。
22、步骤(2)所述的特异性寡核苷酸探针为，基于待测微生物细胞的rdna序列，根据待测微生物的系统发育树所设计的，特异性的带荧光分子标记的寡核苷酸探针。
23、步骤(3)的步骤包括：
24、1)盖玻片的预处理：将盖玻片在hcl中浸泡后干燥，再将其浸入预热的0.1％的明胶溶液中，然后空气中自然干燥；
25、2)固相fish实验：将固定后的细菌稀释至合适浓度后液滴加在经预处理盖玻片上，空气中自然干燥，让细菌充分粘附在盖玻片表面，酒精梯度脱水后，在样品上原位滴加探针和杂交缓冲液，暗处杂交后，冲去探针，然后将玻片继续置于预热的洗脱缓冲液中，暗处洗脱后，用蒸馏水将盖玻片小心冲洗干净，空气中自然干燥；
26、3)荧光显微镜观察：将盖玻片样品朝下倒扣在载玻片上，制成三明治结构，进行荧光显微镜观察，整个观察过程中样品不与任何液体(如香柏油)直接接触；
27、4)sem观察：荧光显微镜观察结束后，将盖玻片从载玻片上取下，样品朝上，固定在sem专用的铝座支架上，使用真空喷碳仪在样品表面喷约15nm厚的碳薄膜层，使样品能够导电，然后进行sem观察。
28、步骤(4)的步骤包括：
29、1)液相fish：将固定后的细菌置于1.5ml的eppendorf离心管，采用离心的方式本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种荧光显微镜和电子显微镜联用，对微生物细胞同时进行种类鉴定和生物矿化分析的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种类鉴定是指通过改进的荧光原位杂交技术，鉴定微生物的种属；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的细胞固定方法为：
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的特异性寡核苷酸探针为，基于待测微生物细胞的rDNA序列，根据待测微生物的系统发育树所设计的，特异性的带荧光分子标记的寡核苷酸探针。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)的步骤包括：
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)的步骤包括：
9.权利要求1-8任一项所述的方法在鉴定微生物细胞的种类和生物矿化机理中的应用。
10.使用权利要求1-8任一项所述的方法鉴定分离的微生物细胞。p>...
【技术特征摘要】
1.一种荧光显微镜和电子显微镜联用，对微生物细胞同时进行种类鉴定和生物矿化分析的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种类鉴定是指通过改进的荧光原位杂交技术，鉴定微生物的种属；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的细胞固定方法为：
6.根据权利要求1或2所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：李金华，张衡，王芙仙，刘文琪，刘沛余，潘永信，
申请(专利权)人：中国科学院地质与地球物理研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。