【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学制药或疫苗佐剂或兽用疫苗佐剂领域，涉及一种toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物及其制备方法与应用，以及所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒及其制备方法与应用。
技术介绍
1、与单独使用抗原相比，佐剂作为一类添加在疫苗中的免疫调节剂，能够极大的增强机体免疫应答的强度、响应速度及持续水平。因此，佐剂的重要性绝不亚于抗原。长久以来，佐剂的研发进展非常缓慢，远远不能满足疫苗开发的需要。现有的人用疫苗以应用铝盐佐剂为主。近年来，gsk公司研发的as系列佐剂亦用于人乳头瘤病毒、带状疱疹病毒的高价疫苗产品。动物疫苗市场主要应用的是矿物油佐剂，包括：弗氏佐剂、白油司本佐剂和isa206等。矿物油佐剂的免疫增强效果尚可，但因其不稳定且粘稠，在体内不易代谢，毒副作用较大。
2、先天免疫系统可通过免疫细胞中的模式识别受体(prrs)感知微生物携带的pamp，并由此激活先天免疫系统。基于此发现，具有prrs特征的toll样受体(tlrs)、nod样受体(nlrs)、c型凝集素受体和rig-i受体相继被发掘。其中，tlr7是佐剂研发的热门靶点。现有的tlr7激动剂主要为人工合成的小分子结构，截止目前，3m公司研发的激动剂r837已被批准用于基底细胞癌的免疫治疗，另有30余种tlr7激动剂进入临床试验阶段。研究表明，tlr7激动剂具有显著的免疫增强活性，但作为疫苗佐剂还存在以下问题：(1)、市场上常见的tlr7激动剂水溶性较差，难以与疫苗直接配伍；(2)、小分子结构的tlr7激动剂进入体内后扩散进入血管，易引发全
3、壳聚糖(chitosan，简记为cs)是唯一天然来源的正电性多糖，成本低廉，且具有一定的cgas-sting通路的激活能力，因此，壳聚糖的佐剂活性研究也正在广泛开展。然而，壳聚糖用于佐剂领域，存在两点缺陷：(1)壳聚糖仅在酸性水溶液中可溶，在常规疫苗的中性水溶液中不溶；(2)壳聚糖的阳离子特性可增加细胞摄取，但也会带来一定的细胞毒性。当壳聚糖的浓度≥50μg/ml时，即会显著的影响细胞增殖。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是提供一种toll样受体7(tlr7)激动剂-壳寡糖(chitosanoligosaccharide，简记为cos)偶联物。
2、本专利技术的目的之二是提供一种tlr7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法。
3、本专利技术的目的之三是提供一种tlr7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒。
4、本专利技术的目的之四是提供一种tlr7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒的制备方法。
5、本专利技术的目的之五是提供所述的tlr7激动剂-壳寡糖偶联物或其纳米颗粒作为兽用疫苗佐剂的应用。
6、本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
7、一种toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物(记为tc偶联物)，它是以结构如式ⅰ所示的tlr7激动剂与壳寡糖分子上部分氨基通过酰胺化反应制得的；
8、
9、所述的壳寡糖中伯氨基与tlr7激动剂的投料摩尔比为1:0.05～1:0.5，对应的，所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物中，tlr7激动剂在壳寡糖上的偶联率为6.5～51.5mol％。
10、优选的，所述的壳寡糖中伯氨基与tlr7激动剂的投料摩尔比为1:0.1～1:0.4，对应的，所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物中，tlr7激动剂在壳寡糖上的偶联率为10～40.1mol％。
11、壳寡糖又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术(也有使用化学降解、微波降解技术的报道)降解得到的一种寡糖产品。本专利技术所述的壳寡糖的分子量≤1500。
12、一种所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法，包括：将tlr7激动剂溶解在含有三乙胺的dmf中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)，室温搅拌；再加入壳寡糖水溶液，继续室温搅拌；反应结束后，将反应液加入过量的乙腈中洗涤，离心，取沉淀；沉淀自然风干，再溶于去离子水，离心，取上清液，上清液冷冻干燥，得到toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物。
13、所述的tlr7激动剂在dmf中的浓度为10～110mg/ml。
14、所述的tlr7激动剂与hatu的摩尔比为1:1.1；所述的tlr7激动剂与三乙胺的摩尔比1:2.5～1:4。
15、所述的dmf与壳寡糖水溶液的体积比为1:1.5～1:2.5。当反应体系中dmf与水(以壳寡糖水溶液计)的体积比从1:1.5～2.5调整到1:1时，即使延长反应时间，tlr7激动剂的偶联率也会显著下降。
16、所述的tlr7激动剂与hatu的反应时间为5～10min；加入壳寡糖水溶液后，反应时间为2～10h。
17、所述的反应液和乙腈的体积比为1:4。
18、将所述的沉淀溶解在去离子水中配成浓度20mg/ml的溶液。
19、优选的，按照反应液和乙腈的体积比为1:4，将反应液加入到乙腈中洗涤，以10000rpm的速率离心5min，取沉淀；沉淀自然风干，再溶于去离子水配成浓度20mg/ml的溶液，以10000rpm的速率离心纯化5min，取上清液，上清液冷冻干燥，得到toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物。
20、一种tlr7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒(记为tc偶联物纳米颗粒)，它是以nacl水溶液为反应溶剂，以所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物与负电性聚合物为原料，通过离子交联形成的纳米凝胶颗粒。
21、所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物通过表面剩余的伯氨基与负电性聚合物表面的阴离子基团相互碰撞，离子交联形成纳米凝胶颗粒。
22、所述的tlr7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒的本体粒径为50nm左右。
23、一种所述的tlr7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒的制备方法，包括：采用nacl水溶液分别配制负电性聚合物溶液、toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液，以负电性聚合物溶液为底液，边搅拌边将toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液滴加到底液中，搅拌，得到tlr7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒的分散液。
24、所述nacl水溶液中nacl的浓度为0.9％。
25、所述的负电性聚合物为硫酸葡聚糖、聚谷氨酸或透明质酸。
26、所述的负电性聚合物溶液和所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液的体积比为2:0.5～2:2；所述的负电性聚合物溶液的浓度为0.5～4mg/ml，所述toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液的浓度为0.5～2mg/ml。
27、所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液的滴加速率为5～25ml/h；搅拌速率为100～500rpm，滴加完毕后的搅拌时间为5～10min。
28、所述的toll样受体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物，其特征在于：它是以结构如式Ⅰ所示的TLR7激动剂与壳寡糖氨基通过酰胺化反应制得的；所述的壳寡糖中伯氨基与TLR7激动剂的摩尔比为1:0.05～1:0.5；
2.根据权利要求1所述的Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物，其特征在于：所述的壳寡糖中伯氨基与TLR7激动剂的投料摩尔比为1:0.1～1:0.4。
3.一种权利要求1所述的Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法，其特征在于：包括：将TLR7激动剂溶解在含有三乙胺的DMF中，加入HATU，室温搅拌；再加入壳寡糖水溶液，继续室温搅拌；反应结束后，将反应液加入过量的乙腈中洗涤，离心，取沉淀；沉淀自然风干，再溶于去离子水，离心，取上清液，上清液冷冻干燥，得到Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物。
4.根据权利要求3所述的Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法，其特征在于：所述的TLR7激动剂在DMF中的浓度为10～110mg/mL；所述的TLR7激动剂与HATU的摩尔比为1:1.1；所述的TLR7激动剂与三乙胺的摩尔比1:2.5～1:4
5.根据权利要求3所述的Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法，其特征在于：所述的DMF与壳寡糖水溶液的体积比为1:1.5～1:2.5。
6.根据权利要求3所述的Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法，其特征在于：所述的TLR7激动剂与HATU的反应时间为5～10min；加入壳寡糖水溶液后，反应时间为2～10h。
7.一种TLR7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒，其特征在于：它是以NaCl水溶液为反应溶剂，以所述的Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物与负电性聚合物为原料，通过离子交联形成的纳米凝胶颗粒。
8.一种权利要求7所述的TLR7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括：采用NaCl水溶液分别配制负电性聚合物溶液、Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液，以负电性聚合物溶液为底液，边搅拌边将Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液滴加到底液中，搅拌，得到TLR7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒的分散液；
9.权利要求1所述的Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物或权利要求7所述的TLR7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒作为疫苗佐剂在制备兽用疫苗中的应用。
10.一种兽用疫苗，其特征在于：它是采用0.9％的NaCl溶液分别配制含有抗原的负电性聚合物溶液、Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液；以含有抗原的负电性聚合物溶液为底液，将Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物溶液滴加到滴液中，搅拌，过滤除菌，得到包裹抗原的Toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物纳米颗粒的水剂型疫苗；
...【技术特征摘要】
1.一种toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物，其特征在于：它是以结构如式ⅰ所示的tlr7激动剂与壳寡糖氨基通过酰胺化反应制得的；所述的壳寡糖中伯氨基与tlr7激动剂的摩尔比为1:0.05～1:0.5；
2.根据权利要求1所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物，其特征在于：所述的壳寡糖中伯氨基与tlr7激动剂的投料摩尔比为1:0.1～1:0.4。
3.一种权利要求1所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法，其特征在于：包括：将tlr7激动剂溶解在含有三乙胺的dmf中，加入hatu，室温搅拌；再加入壳寡糖水溶液，继续室温搅拌；反应结束后，将反应液加入过量的乙腈中洗涤，离心，取沉淀；沉淀自然风干，再溶于去离子水，离心，取上清液，上清液冷冻干燥，得到toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物。
4.根据权利要求3所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法，其特征在于：所述的tlr7激动剂在dmf中的浓度为10～110mg/ml；所述的tlr7激动剂与hatu的摩尔比为1:1.1；所述的tlr7激动剂与三乙胺的摩尔比1:2.5～1:4。
5.根据权利要求3所述的toll样受体7激动剂-壳寡糖偶联物的制备方法，其特征在于：所述的dmf与壳寡糖水溶液的体积比为1:1.5～1:2.5。
6.根据权利要求3所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦竹，郑其升，张元鹏，杨利，侯立婷，陈瑾，于晓明，李兰，杜露平，乔绪稳，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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