【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因及应用。
技术介绍
1、灯盏花(erigeron breviscapus(vant.)hand.-mazz.)又名灯盏细辛或短葶飞蓬,为菊科飞蓬属多年生草本植物，主要分布于我国云南、四川、贵州、广西、西藏、湖南等西部和西南部海拔1200～3500m的中山和亚高山开阔山坡草地、林缘或疏林下。灯盏花的主要药用成分为灯盏乙素，是治疗心脑血管类疾病的良好用药。相关药品有注射用灯盏花素、灯盏细辛注射液、灯盏花注射液等，总产值达50多亿元，药材需求量以每年15％的速度持续增长。
2、研究发现灯盏乙素在叶片中含量最高，莲座叶也是构成灯盏花产量的主要部分。植物叶片的起始发生在茎顶端分生组织(sam)的特定区域，生长素在此过程中扮演关键角色。吲哚丙酮酸途径是植物体内最基本的也是最主要的一条生长素合成途径。yuc和taa基因家族是生长素合成和植物发育过程中最重要的催化酶系。生长素的生物合成主要包括两个步骤，第一步中，l-色氨酸(trp)通过拟南芥转氨酶家族taa转化为3-吲哚丙酸(ipa)，在第二步中，ipa被yuccas(yucs)家族转化为吲哚-3-乙酸(iaa)，因此yuc家族在植物生长发育中扮演重要角色。
3、灯盏花具有良好的研究基础，有高质量的基因组和多叶少叶重测序数据。同时，灯盏乙素已实现酵母全合成。已成功构建灯盏花遗传转化体系包括叶片诱导愈伤组织，农杆菌侵染愈伤组织，潮霉素作为筛选剂，依次共培养、筛选、分化、生根，得到一棵完整的
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因。
2、为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因，所述调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因的核酸序列如seq id no：1所示。
4、所述的调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因所编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
5、本专利技术还提供了一种调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因在选育灯盏花新品种中的应用。
6、所述选育的方法包括以下步骤：
7、(1)cdna模板的制备；
8、(2)目的基因的克隆及回收；
9、(3)基因重组载体的构建与鉴定；
10、(4)表达质粒转化农杆菌；
11、(5)蘸花法转化拟南芥；
12、(6)ebyuc2过表达灯盏花。
13、所述步骤(1)中cdna模板的制备包括以下步骤：以新鲜灯盏花叶片为材料，采用试剂盒进行rna提取，使用反转录试剂盒将rna反转录成cdna，-20℃保存备用。
14、所述步骤(2)中目的基因的克隆及回收包括以下步骤：用灯盏花叶片克隆目的基因，pcr反应体系为94℃、5min，94℃、30s，62℃、50s，72℃、1min循环35次，72℃、7min，反应结束后，使用试剂盒进行目的基因回收，-20℃保存备用。
15、所述步骤(3)中基因重组载体的构建与鉴定包括以下步骤：通过bamhl和sacl内切酶酶切得到线性化载体，利用同源重组进行目的基因的重组转化，转化后进行菌落pcr检测和测序，得阳性转化子；所述步骤(4)中表达质粒转化农杆菌包括以下步骤：将所述阳性转化子转入eha105感受态细胞，用含kan的lb固体培养基涂布平板，培养，然后取单个菌落用lb+kan液体培养基培养，用甘油将阳性菌进行保菌。
16、所述步骤(6)中ebyuc2过表达灯盏花包括以下步骤：侵染，共培养阶段，延迟筛选培养阶段，筛选培养阶段，第一阶段分化培养，第二阶段分化培养，生根阶段。
17、所述共培养基包括如下成分：4.74g/l ms+0.5mg/l 2，4d+1mg/l naa+3％蔗糖+0.8％琼脂+5％as；
18、延迟筛选培养基包括如下成分：4.74g/l ms+4mg/l 6-ba+0.5mg/l 2，4d+0.5mg/ltdz+3％蔗糖+0.8％琼脂+3mg/ml tmt；
19、筛选培养基包括如下成分：4.74g/l ms+4mg/l6-ba+0.5mg/l 2，4d+3％蔗糖+0.8％琼脂+3mg/mltmt+10mg/l hyg，或4.74g/l ms+4mg/l 6-ba+2mg/l naa+0.5mg/l tdz+3％蔗糖+0.8％琼脂3mg/mltmt+10mg/l hyg；
20、第一阶段分化培养基包括如下成分：2g/l sh+1mg/l 6-ba+0.5mg/l 2，4d+80mg/lad+50mg/l glu+2g/l ch+3％蔗糖+0.8％琼脂+3mg/ml tmt+5mg/lhyg；
21、第二阶段分化培养基包括如下成分：4.74g/l ms+0.5mg/l kt+0.3mg/l naa+3％蔗糖+0.8％琼脂+3mg/ml tmt+5mg/l hyg或ms基础培养基+3mg/l naa+3％蔗糖+0.8％琼脂+3mg/ml tmt+5mg/l hyg；
22、生根阶段培养基包括如下成分：1/2ms+0.1mg/lnaa+10g/l蔗糖+8g/l琼脂。
23、本专利技术中，进行了99个多叶晚花类型和少叶早花单株重测序，利用gwas鉴定可能与叶数相关基因吲哚-3-丙酮酸单氧酶(yuc2)，命名为ebyuc2。
24、本专利技术具有以下有益效果：
25、根据ebyuc2的序列，从ncbi-blastx筛选出拟南芥(arabidopsis thaliana)、向日葵(helianthus annuus)、菊苣(lactuca sativa)、朝鲜蓟(cynara cardunculus)植物中ebyuc2基因的同源序列，使用mega-x软件构建系统发育树。使用mega-x软件做ebyuc2与拟南芥(at4g13260.1)、菊苣(xp-023760270.1)和朝鲜蓟(xp-024979791.1)同源蛋白的保守基序分析。
26、提取时，先提取灯盏花中rna，再反转录为cdna，cdna经pcr扩增后获得所述ebyuc2基因；pcr扩增所采用的特异性引物为：
27、上游引物：agaacacgggggacgagctcatggaagaatatgcaaagag
28、下游引物：cccttgctcaccatggtaccttatggtggtggatgctgta
29、本研究通过双酶切得到线性化载体，利用同源重组进行目的基因的重组转化，转化后进行菌落pcr检测和测序，测序后与ebyuc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶EbYUC2基因，其特征在于，所述调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶EbYUC2基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶EbYUC2基因所编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶EbYUC2基因在选育灯盏花新品种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述选育的方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中cDNA模板的制备包括以下步骤：以新鲜灯盏花叶片为材料，采用试剂盒进行RNA提取，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中目的基因的克隆及回收包括以下步骤：用灯盏花叶片克隆目的基因，PCR反应体系为94℃、5min，94℃、30s，62℃、50s，72℃、1min循环35次，72℃、7min，反应结束后，使
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中基因重组载体的构建与鉴定包括以下步骤：通过BamHl和Sacl内切酶酶切得到线性化载体，利用同源重组进行目的基因的重组转化，转化后进行菌落PCR检测和测序，得阳性转化子；所述步骤(4)中表达质粒转化农杆菌包括以下步骤：将所述阳性转化子转入EHA105感受态细胞，用含Kan的LB固体培养基涂布平板，培养，然后取单个菌落用LB+Kan液体培养基培养，用甘油将阳性菌进行保菌。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(6)中EbYUC2过表达灯盏花包括以下步骤：侵染，共培养阶段，延迟筛选培养阶段，筛选培养阶段，第一阶段分化培养，第二阶段分化培养，生根阶段。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.一种调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因，其特征在于，所述调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因的核酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因所编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
3.一种调控灯盏花叶数吲哚-3-丙酮酸单氧酶ebyuc2基因在选育灯盏花新品种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述选育的方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中cdna模板的制备包括以下步骤：以新鲜灯盏花叶片为材料，采用试剂盒进行rna提取，使用反转录试剂盒将rna反转录成cdna，-20℃保存备用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中目的基因的克隆及回收包括以下步骤：用灯盏花叶片克隆目的基因，pc...
【专利技术属性】
技术研发人员：和四梅，杨云会，朱琴，关德军，张尚林，张旭高，沙本才，杨生超，张广辉，刘冠泽，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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