【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结构光照明超分辨显微成像技术，快照式光谱成像技术，以及光场成像技术。
技术介绍
1、在过去的二十年间，超分辨显微技术蓬勃发展，提供了超越光学衍射极限分辨率的成像性能，将人类用光学成像方法所表示的分辨率极限从200nm提升到了10-150nm，极大增进了对生物细胞结构与生命活动机理的理解与研究，成就了细胞和亚细胞水平研究的突破性进展。目前主流的超分辨显微技术主要有三类：基于不同波长激光调控的单分子定位显微，基于光学系统点扩展函数调制的受激发射损耗显微和基于空间调制照明的结构光照明显微。在众多超分辨显微技术中，基于空间调制照明的结构光照明显微在分辨率上并不突出，但由于重构所需原始图像数量少、成像速度快、所需照明光强低、能使用普通荧光染料成像等优点，在超分辨生物成像中应用最为广泛，尤其适合活细胞成像。
2、荧光染色技术多样化发展，多荧光标记和结合量子点等其他标记方法的复合标记让生物样本呈现多强度、多波长的光学编码特性。波长λ维度的样本解析可将目标形貌、空间位置与物质结构、化学组成有机联系起来。具有一定厚度的样本仅能看到其二维平面的形态还不足以让生物学研究者洞悉生命现象，(x,y,z)三维立体成像才能更直观的展现细胞的全貌。如果能将上述两者结合，在不同光谱通道获得细胞的超分辨三维空间信息，即(x,y,z,λ)四维成像，则可清晰解剖出细胞的空间理化特征，达到“透视”样本的目的。另外，活体细胞的研究还需要能够捕捉其动态变化的成像手段，因此，(x,y,z,λ)的成像只有满足一定时间分辨率的要求才能洞察生命活动的细微快
技术实现思路
1、为克服现有技术的不足，实现快速追踪动态样本在不同波长通道下的三维结构变化，解决目前超分辨成像系统无法实时对细胞三维结构及其光谱特征同时解析的问题。为此，本专利技术采取的技术方案是，高光谱结构光照明光场显微成像系统，包括结构光照明显微系统、预放大系统、微透镜阵列、色散分光系统、图像采集系统和计算机；样品首先经过结构光照明显微系统中的结构光照明系统的结构光照明，激发样品发射荧光，然后结构光照明显微系统中的显微成像系统对所发射的荧光进行显微成像，所成的像称为样品的原始图像，原始图像再由预放大系统放大后，被微透镜阵列采样并聚焦为图像点阵，图像点阵经过色散分光系统形成图像点阵的谱线阵列，谱线阵列被图像采集系统记录，在计算机中通过图像重构方法对图像采集系统所记录到的图像进行图像重构，重构出不同波长通道下的超分辨三维立体图像。
2、所述结构光照明显微系统，包括基于数字微镜器件的正弦结构光照明系统、空间滤波系统以及显微成像系统，其中，基于数字微镜器件的正弦结构光照明系统是将入射到数字微镜器件表面的平行光，调制为周期正弦结构光；空间滤波系统，对上述正弦结构光进行空间滤波，只保留±1级的衍射光，两级光发生干涉形成结构光照明样本；显微成像系统为通用显微镜。
3、所述预防大系统，物面与结构光照明显微系统的像面重合，对样品原始图像成放大实像，图像以合适的比例放大后，显微原始图像的分辨率不因后续光路而损失。
4、所述微透镜阵列，与预防大系统的像面重合，采样放大后的样品原始图像并聚焦成图像点阵，同时用于获取样品的三维光场信息。
5、所述色散分光系统，包括准直透镜、分光棱镜以及聚焦透镜，准直透镜的前焦面与微透镜阵列的像面重合，将微透镜阵列所成的图像点阵准直，平行光入射到分光棱镜色散，再由聚焦透镜聚焦形成整齐排列的谱线阵列。
6、高光谱结构光照明光场显微成像方法，利用前述成像系统实现，利用深度学习从色散分光系统形成图像点阵的谱线阵列中提取出单色光场信息，作为三维重建算法的输入值；再通过三维重建算法，从单色光场信息同重建出样片不同深度的原始图像，将其作为超分辨重构算法的输入值；超分辨重构算法是利用三维重建算法到的单色特定深度样本图像，计算出因结构光照射而扩展的频谱信息，再利用维纳反卷积以及频谱移动来重构出单色特定深度的超分辨图像；利用所述深度学习从所述图像点阵的谱线阵列提取到其他波长的光场信息，再利用所述三维重建算法得到该波长的不同深度的原始图像，重复所述超分辨重构算法过程，在不同光谱通道获得样品的超分辨三维空间信息，即(x,y,z,λ)四维成像，(x,y,z)为三维空间坐标，λ为波长坐标。
7、三维重建算法具体步骤如下：一束光线的函数表达式可以表示为l(u,v,s,t)，其中(u,v)(s,t)是光线与两个平行平面的交点；将预防大系统看作uv面，将图像探测器看作st面，则从uv面射向st平面上某点的图像辐射照度可以由光线辐射度的积分公式表示：
8、
9、其中：d为两个平面之间的距离，ed表示st平面上某一点的辐射度；
10、对单色光场信息进行重聚焦时，由几何关系推导出透镜面与新聚焦面所定义的光场函数：
11、
12、则根据式(2)得到重聚焦面上一点的辐照度的积分公式为：
13、
14、对于离散点，积分近似为求和，并且每次移动后的图像被叠加以获得重新聚焦的图像；
15、利用式(3)，从样品的单色光场信息中得到其不同深度的结构光照明原始图像，用于后续的超分辨重建。
16、超分辨重构算法具体步骤如下：重建算法包括：
17、超分辨重构共需要9幅原始图像，即3种不同方向，每个方向3种条纹相位共9幅结构光照明原始图像，每幅图像的用如下表达：
18、d(r)＝[s(r)×i(r)]*h(r) (4)
19、其中s(r)为样品的荧光标记分布；i(r)为照明光的分布；h(r)为系统的点扩散函数；r为空间坐标；*为卷积运算；
20、从空间频谱传递的角度来看成像，任意空域(x,y,z)图像都等效于其在空间频域(kx,ky,kz)内的空间频谱，光学系统的成像则等效于为在空间频域内传递图像空间频谱的过程。式(4)作傅里叶变换得到：
21、
22、～代表函数的傅里叶变换，k为频域的坐标，是h(r)是的傅里叶变换，又被称为光学传递函数otf，结构光显微镜采用余弦光进行调制：
23、
24、i(r)为激发光，i0为平均光照强度，m为调制深度，p为条纹频率，代表着相位，对式(6)进行傅里叶变换得到
25、
26、由三个脉冲δ函数组成，与脉冲函数卷积的函数会发生空间平移，将代入(5)得到：
27、
28、是加载余弦条纹的样本图案对应的频谱，根据卷积定理的平移特性，它的频谱由三部分物频谱组成，分别为其中和为分别沿着条纹周期的方向移动了+p和–p，三部分频谱叠加形成了结构光调制下图像的频谱分布；
29、为求解式(8)的三个频谱分量至少需要3个方程，改变条纹的相位获得三幅结构光照明原始图像，联立方程得到式(9)：
30、
31、通过频谱自相关算法计算得到每本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高光谱结构光照明光场显微成像系统，其特征是，包括结构光照明显微系统、预放大系统、微透镜阵列、色散分光系统、图像采集系统和计算机；样品首先经过结构光照明显微系统中的结构光照明系统的结构光照明，激发样品发射荧光，然后结构光照明显微系统中的显微成像系统对所发射的荧光进行显微成像，所成的像称为样品的原始图像，原始图像再由预放大系统放大后，被微透镜阵列采样并聚焦为图像点阵，图像点阵经过色散分光系统形成图像点阵的谱线阵列，谱线阵列被图像采集系统记录，在计算机中通过图像重构方法对图像采集系统所记录到的图像进行图像重构，重构出不同波长通道下的超分辨三维立体图像。
2.如权利要求1所述的高光谱结构光照明光场显微成像系统，其特征是，所述结构光照明显微系统，包括基于数字微镜器件的正弦结构光照明系统、空间滤波系统以及显微成像系统，其中，基于数字微镜器件的正弦结构光照明系统是将入射到数字微镜器件表面的平行光，调制为周期正弦结构光；空间滤波系统，对上述正弦结构光进行空间滤波，只保留±1级的衍射光，两级光发生干涉形成结构光照明样本；显微成像系统为通用显微镜。
3.如权利要求1所
4.如权利要求1所述的高光谱结构光照明光场显微成像系统，其特征是，所述微透镜阵列，与预防大系统的像面重合，采样放大后的样品原始图像并聚焦成图像点阵，同时用于获取样品的三维光场信息。
5.如权利要求1所述的高光谱结构光照明光场显微成像系统，其特征是，所述色散分光系统，包括准直透镜、分光棱镜以及聚焦透镜，准直透镜的前焦面与微透镜阵列的像面重合，将微透镜阵列所成的图像点阵准直，平行光入射到分光棱镜色散，再由聚焦透镜聚焦形成整齐排列的谱线阵列。
6.一种高光谱结构光照明光场显微成像方法，其特征是，利用权利要求1所述的成像系统实现，利用深度学习从色散分光系统形成图像点阵的谱线阵列中提取出单色光场信息，作为三维重建算法的输入值；再通过三维重建算法，从单色光场信息同重建出样片不同深度的原始图像，将其作为超分辨重构算法的输入值；超分辨重构算法是利用三维重建算法到的单色特定深度样本图像，计算出因结构光照射而扩展的频谱信息，再利用维纳反卷积以及频谱移动来重构出单色特定深度的超分辨图像；利用所述深度学习从所述图像点阵的谱线阵列提取到其他波长的光场信息，再利用所述三维重建算法得到该波长的不同深度的原始图像，重复所述超分辨重构算法过程，在不同光谱通道获得样品的超分辨三维空间信息，即(x,y,z,λ)四维成像，(x,y,z)为三维空间坐标，λ为波长。
7.如权利要求6所述的高光谱结构光照明光场显微成像方法，其特征是，三维重建算法具体步骤如下：一束光线的函数表达式可以表示为L(u,v,s,t)，其中(u,v)(s,t)是光线与两个平行平面的交点；将预防大系统看作uv面，将图像探测器看作st面，则从uv面射向st平面上某点的图像辐射照度可以由光线辐射度的积分公式表示：
8.如权利要求6所述的高光谱结构光照明光场显微成像方法，其特征是，超分辨重构算法具体步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种高光谱结构光照明光场显微成像系统，其特征是，包括结构光照明显微系统、预放大系统、微透镜阵列、色散分光系统、图像采集系统和计算机；样品首先经过结构光照明显微系统中的结构光照明系统的结构光照明，激发样品发射荧光，然后结构光照明显微系统中的显微成像系统对所发射的荧光进行显微成像，所成的像称为样品的原始图像，原始图像再由预放大系统放大后，被微透镜阵列采样并聚焦为图像点阵，图像点阵经过色散分光系统形成图像点阵的谱线阵列，谱线阵列被图像采集系统记录，在计算机中通过图像重构方法对图像采集系统所记录到的图像进行图像重构，重构出不同波长通道下的超分辨三维立体图像。
2.如权利要求1所述的高光谱结构光照明光场显微成像系统，其特征是，所述结构光照明显微系统，包括基于数字微镜器件的正弦结构光照明系统、空间滤波系统以及显微成像系统，其中，基于数字微镜器件的正弦结构光照明系统是将入射到数字微镜器件表面的平行光，调制为周期正弦结构光；空间滤波系统，对上述正弦结构光进行空间滤波，只保留±1级的衍射光，两级光发生干涉形成结构光照明样本；显微成像系统为通用显微镜。
3.如权利要求1所述的高光谱结构光照明光场显微成像系统，其特征是，所述预防大系统，物面与结构光照明显微系统的像面重合，对样品原始图像成放大实像，图像以合适的比例放大后，显微原始图像的分辨率不因后续光路而损失。
4.如权利要求1所述的高光谱结构光照明光场显微成像系统，其特征是，所述微透镜阵列，与预防大系统的像面重合，采样放大后的样品原始图像并聚焦成图像点阵，同时用于获取样品的三维光场信息。
5.如权利...
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