【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及烟草多酚氧化酶ntppo6及其编码基因、基因编辑载体和应用，属于植物基因工程。
技术介绍
1、多酚氧化酶(ppo，polyphenol oxidase)是在自然界中广泛存在的一类铜结合酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。根据其底物的特异和作用机制，可分为三类：酪氨酸酶(ec 1.14.18.1)、儿茶酚氧化酶(ec 1.10.3.1)和漆酶(ec 1.10.3.2)。
2、多酚氧化酶具有多种功能：(1)参与了植物的生长和发育过程，如花朵开放、果实成熟和叶片的黄化等；(2)将植物中多酚类物质(如酪酸、儿茶酚等)转化为具有较高活性的氧化产物，如喹啉、喹啉醇等，这种氧化反应通常以分子氧为底物，产生的氧化产物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌和抗肿瘤等；(3)多酚底物被ppo氧化，被认为是许多水果和蔬菜在收获、储存、运输和加工过程中棕色变色的主要原因，因此抑制多酚氧化酶的活性可以提高食品的保鲜性和品质；(4)多酚氧化酶还可以应用于环境保护领域，能够催化工业废水和水体中的有机物的氧化降解，从而减少水体污染；(5)多酚氧化酶还可以用于处理农药和有机污染物的土壤和废物。正是由于多酚氧化酶应用领域逐渐扩大，人们对多酚氧化酶的研究也越来越深入。
3、植物中的多酚氧化酶基因不仅功能复杂，而且多以基因家族的形式存在。目前研究者们在马铃薯、番茄、玉米、大豆、丹参、烟草等植物中均鉴定出多个多酚氧化酶，如在茄科经济作物茄子中找到6个ppo基因；番茄中发现7个ppo基因；马铃薯中有2个ppo基因。红三叶草中找到至少6个p
技术实现思路
1、本专利技术的第一个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6，以解决现有技术中烟草多酚氧化酶基因家族有部分成员未知的问题。
2、本专利技术的第二个目的是提供烟草多酚氧化酶ntppo6，以解决现有技术中烟草多酚氧化酶家族有部分成员未知的问题。
3、本专利技术的第三个目的是提供基因编辑载体，以解决现有技术中无合适的研究工具研究ntppo6基因功能的问题。
4、本专利技术的第四个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用，以解决现有技术中对烟草多酚氧化酶基因家族研究不够深入，而导致存在多酚氧化酶基因功能在烟草中未知的问题。
5、本专利技术的第五个目的是提供烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用，以解决现有技术中对烟草多酚氧化酶基因家族研究不够深入，而导致存在多酚氧化酶基因功能在烟草中未知的问题。
6、为了实现上述目的，本专利技术烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6所采用的技术方案是：
7、烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6，其核苷酸序列为：
8、(1)seq id no.1所示的核苷酸序列；
9、或(2)seq id no.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
10、上述技术方案的有益效果在于：本专利技术在前期研究的基础上，以普通烟草不同时期叶片的cdna为模板，利用pcr技术，克隆获得了烟草多酚氧化酶的同源基因，命名为ntppo6。本专利技术通过对ntppo6基因的克隆、烟草多酚氧化酶ntppo6氨基酸序列分析、ntppo6基因的表达模式分析和ntppo6基因编辑烟草植株的构建发现，在烟草植株中敲除ntppo6基因后能显著降低叶片中多酚氧化酶的活性，说明其确实为多酚氧化酶基因家族成员。本专利技术发现的烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6，丰富了烟草多酚氧化酶基因家族，为研究烟草中多酚氧化酶功能奠定基础。
11、为了实现上述目的，本专利技术烟草多酚氧化酶ntppo6所采用的技术方案是：
12、烟草多酚氧化酶ntppo6，其氨基酸序列为：
13、(1)seq id no.2所示的氨基酸序列；
14、或(2)seq id no.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
15、上述技术方案的有益效果在于：本专利技术通过分析烟草多酚氧化酶ntppo6的氨基酸结构，预测其为烟草多酚氧化酶家族成员，通过构建ntppo6基因编辑烟草植株，通过检测其叶片中多酚氧化酶的活性，发现敲除ntppo6基因后，烟草叶片中多酚氧化酶的含量显著下降，证明了烟草多酚氧化酶ntppo6确实参与调控烟草中的多酚氧化酶活性。
16、为了实现上述目的，本专利技术基因编辑载体所采用的技术方案是：
17、基因编辑载体，所述基因编辑载体中包含根据ntppo6基因所设计的靶位点敲除序列，所述ntppo6基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
18、上述技术方案的有益效果在于：利用基因编辑技术，根据ntppo6基因设计敲除序列，构建基因编辑载体，转化烟草后，检测发现ntppo6基因成功敲除，说明本专利技术构建的基因编辑载体能有效敲除ntppo6基因，为后续该基因功能的研究提供良好的工具。
19、作为进一步地改进，依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：
20、ntppo6-c-f：5’-gattgtcccctactcttacacaatg-3’；
21、ntppo6-c-r：5’-aaaccattgtgtaagagtaggggac-3’。
22、为了实现上述目的，本专利技术烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用所采用的技术方案是：
23、烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用。
24、上述技术方案的有益效果在于：本专利技术通过基因编辑技术，构建基因编辑载体，转入烟草中，成功敲除ntppo6基因，获得ntppo6基因敲除的烟草植株。通过后续检测发现ntppo6基因敲除的烟草植株的叶片中绿原酸含量显著提高，为获得绿原酸含量增加的烟草品种奠定基础。
25、作为进一步地改进，在获得绿原酸含量升高的烟草品种中的应用。
26、为了实现上述目的，本专利技术烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用所采用的技术方案是：
27、烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用。
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1.烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6，其特征在于：其核苷酸序列为：
2.烟草多酚氧化酶NtPPO6，其特征在于：其氨基酸序列为：
3.基因编辑载体，其特征在于：所述基因编辑载体中包含根据NtPPO6基因所设计的靶位点敲除序列，所述NtPPO6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的基因编辑载体，其特征在于：依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：
5.一种如权利要求1所述的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或权利要求3或4所述的基因编辑载体在烟草品种育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草品种育种中的应用，其特征在于：在获得绿原酸含量升高的烟草品种中的应用。
7.一种如权利要求1所述的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或权利要求3或4所述的基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用。
8.根据权利要求7所述的烟草多酚氧化酶编码基因NtPPO6或基因编辑载体在烟草植株表型优化中的应用，其特征在于：抑制Nt
...【技术特征摘要】
1.烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6，其特征在于：其核苷酸序列为：
2.烟草多酚氧化酶ntppo6，其特征在于：其氨基酸序列为：
3.基因编辑载体，其特征在于：所述基因编辑载体中包含根据ntppo6基因所设计的靶位点敲除序列，所述ntppo6基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求3所述的基因编辑载体，其特征在于：依据所述靶位点敲除序列所设计的敲除引物序列如下所示：
5.一种如权利要求1所述的烟草多酚氧化酶编码基因ntppo6或权利要求3或4所述的基因编辑载体在...
【专利技术属性】
技术研发人员：武明珠，李亦君，杨小贝，郑庆霞，夏琳，杨军，徐馨，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：
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