【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及油田采出液中硫酸盐还原菌活细胞数量的检测和提高精度的方法。该方法利用qpcr技术直接扩增硫酸盐还原菌的dna，并加入对死细胞dna进行处理，从而使得只能检测活细胞dna数量，从而提高检测的灵敏度和准确性。
技术介绍
1、油田采出液中的硫酸盐还原菌是一种常见的微生物，它们可以利用硫酸盐还原反应产生硫化氢等有毒气体，影响油田开采和生产的效率。因此，准确测定油田采出液中硫酸盐还原菌的数量对于油田开采和生产的管理至关重要。
2、传统的硫酸盐还原菌检测方法包括培养和显微镜观察、生化检测、膜过滤法等，这些方法不仅繁琐，而且存在检测灵敏度低、误差大、检测时间长等问题。近年来，pcr技术的发展为硫酸盐还原菌检测提供了一种高效、准确、快速的方法。
3、qpcr技术是pcr技术的一种变体，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优点，因此成为硫酸盐还原菌检测的理想选择。然而，在应用qpcr技术进行油田采出液中硫酸盐还原菌活细胞数量的检测过程中，仍然存在一些技术难点和局限性，如批次间差异、污染干扰、无法检测活细胞等问题。
4、本专利通过一种直接扩增方法，从而减少了dna提取阶段的dna损失，可提高qpcr检测油田采出液中硫酸盐还原菌活细胞数量的精度和准确性。同时，本专利还提供了一种活细胞检测的方法，可用于评估油田采出液的生物活性和维持采油作业的稳定性。
技术实现思路
1、针对上述研究背景，本专利技术提供了一种通过qpcr直扩提高油田采出液硫酸盐还原菌
2、本专利技术采用如下技术方案：
3、死细胞处理剂处理步骤：
4、将pma溶解于二甲亚砜(dmso)中,配制成0.5mg/ml的pma溶液。在水样中加入pma，使pma的终质量浓度为3μg/ml。
5、pma与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养5min,利用500w的卤素灯曝光5min,光照交联时样品置于冰上(避免过热),且在距光源20cm处；交联后的悬浮液透过0.22μm滤膜。
6、直扩法步骤：
7、将处理后的菌悬液透过0.22μm滤膜，从而使得菌体富集在滤膜上。本专利技术将滤膜加入到1ml te buffer中在95℃条件下裂解5min后就可以作为模板对其进行直接扩增，而无需复杂的提取步骤，更适合现场应用。
8、引物：
9、本专利的引物源自dsra基因，引物序列如下：
10、
11、qpcr程序：
12、本专利使用染料法对目的基因进行扩增。具体程序如下：
13、采用50μlpcr反应体系，其中染料25μl，正向反向引物(10μm)各2μl，模板20μl，水1μl。具体程序为：95℃5min(预变性)，95℃10s(变性)，60℃30s并采集荧光信号(延伸)，40个循环。
14、标准曲线：
15、使用染料法对硫酸盐还原菌进行测定。对硫酸盐还原菌数量的检测属于绝对定量，想要对其数量进行精准判断，需要使用质粒作为标准品绘制标准曲线。使用超微量核酸分析仪对质粒的浓度进行测定，并根据下式换算为拷贝数浓度：
16、
17、经计算，提取的质粒浓度为2.49×109copies/μl。
18、将上述质粒连续十倍稀释，选取2.49×106～2.49×102copyies/μl中每个梯度的质粒作为模板，使用染料法对其进行测定，以拷贝数的对数作为横坐标，ct值为纵坐标绘制标准曲线。建立的线性回归方程y＝-3.2532x+35.815。将所得的ct值代入标准曲线，即可获得所检测的硫酸盐还原菌的具体数量。
19、具体计算公式如下：
20、
21、其中：
22、n是硫酸盐还原菌的数目；
23、f是富集的倍数；
24、y是给定的ct值；
25、a是回归方程的斜率(-3.2532)；
26、b是回归方程的截距(35.815)；
27、本专利技术的有益效果主要包括以下几个方面：
28、1、直扩法可以避免dna损失，并显著简化实验结果，从而提高对菌体数目检测的准确性。
29、2、pma可以显著去除死细胞的干扰，从而避免常规方法过高的估计菌体数目的弊端。
30、3、本专利通过两项技术，使得qpcr更适合现场检测的需求。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于qPCR技术，适用于对硫酸盐还原菌数量进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求书1所述的方法，死细胞处理剂可以通过交联作用抑制死菌对本方法的影响。
3.根据权利要求书1所述的方法，直接扩增可以显著简化qPCR法的操作流程。
4.根据权利要求书1所述的方法，标准曲线仅适用于本方法所使用的的引物及扩增程序。
【技术特征摘要】
1.一种基于qpcr技术，适用于对硫酸盐还原菌数量进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求书1所述的方法，死细胞处理剂可以通过交联作用抑制死菌对本方法的影响...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘其友，苏玉华，陈洪旭，张航，王继国，吕广磊，赵朝成，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：
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