【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种胎牛血清替代物及其制备方法和应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、世界范围内人口数量的激增及水质富营养化所产生的环境问题，使鱼类养殖业正面临前所有未的挑战。细胞培养肉作为综合细胞生物学、生物技术、食品技术的一个全新交叉领域，未来会对可持续肉类生产系统产生巨大影响。细胞培养肉是指在无菌环境下通过组织细胞培养产生的动物肌肉细胞，而不是传统的动物肌肉食品。细胞培养肉作为一项肉类生产的创新技术主要包括种子细胞提取、细胞扩增、细胞分化及食品化技术，可以大幅提高肉类生产效率。胎牛血清是采取自5-8个月胎龄的牛胚胎中的胎血，其富含细胞生长增殖所需的生长因子、激素、氨基酸及脂质等物质，广泛应用于细胞培养。传统细胞培养严重依赖胎牛血清培养基，本质上是不可持续的，并暴露出成本昂贵、动物伦理等问题，因此使用更符合人道的低成本胎牛血清替代物成为重要的研发趋势。
2、肌肉干细胞源于脊椎动物胚胎形成早期的中胚层，一种扁平、有突起的细胞，是骨骼肌再生的必要条件。肌纤维受损后，肌肉干细胞可以快速增殖分化融合形成新的肌纤维。同样，细胞培养肉在体外选择性获取肌肉干细胞后进行快速增殖并诱导分化，促使大量肌肉干细胞融合形成肌纤维。因此需要开发一种适应于大黄鱼肌肉干细胞长期增殖的胎牛血清替代物至关重要。
3、目前，领域内虽然有报道相关无血清培养基配方(cn107488625b；cn115896008a；cn104805054b)，但是不同细胞的营养需求、代谢差异等原因导致无血清培养基不具有普适
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术要解决的技术问题是传统细胞培养严重依赖胎牛血清培养基，本质上是不可持续的，并暴露出成本昂贵、动物伦理等问题，需要开发低成本胎牛血清替代物；另外，不同细胞的营养需求、代谢差异等原因导致无血清培养基不具有普适性，目前未见报道适应于大黄鱼肌肉干细胞培养的无血清培养基。
2、为解决上述问题，本专利技术经过不断的实验和探索，得到了一种胎牛血清替代物，并进一步的将该替代物应用在肌肉干细胞培养的无血清培养中，得到了一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的无血清培养基，该培养基可以用于细胞培养肉中。这有效的促进了大黄鱼肌肉干细胞在细胞培养肉生产过程中快速增殖和稳定传代，为细胞培养肉提供了充足的细胞，有利于细胞培养肉产业化生产。
3、为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现，一种胎牛血清替代物，包括替代物和添加物；其中替代物为抗凝牛血经进行脱纤维处理后，再经离心、重悬、冻融、浓缩处理，得到的产物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂质、its、人血清白蛋白、胎球蛋白、ultroser g。所述替代物是一种混合物，是牛血经过离心、重悬冻融、浓缩后的物质；里面主要是蛋白质等营养物质，但单纯的替代物不足以支撑细胞的生长，因此本专利技术筛选了一些促进细胞增殖的添加物，由替代物和添加物代替胎牛血清。在添加物中，非必需氨基酸的添加可以显著降低细胞自身生产非必需氨基酸的副作用；脂质作为细胞膜的结构组分，在信号传输过程中起到重要作用。its中包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠；胰岛素可以促进细胞对葡萄糖和氨基酸的吸收、脂肪的生成并促进细胞增殖；转铁蛋白是铁离子的重要载体；亚硒酸钠是谷胱甘肽过氧化物酶及其它一些重要酶的辅助因子。人血清白蛋白可以运输脂肪酸、氨基酸、激素等作用。胎球蛋白是一种血浆糖蛋白，具有促进细胞黏附和生长的作用。ultroser g是一种包含激素、生长因子、结合蛋白等细胞生长所必须的营养物质。单独添加以上替代物都不足以支撑细胞增殖，本专利技术经过筛选和实验得到了可以补足替代物不足的营养的添加物，实现替代物和添加物混合后可以代替胎牛血清促进细胞增殖。
4、进一步的，替代物和添加物按照体积比1：0.01～100的比例混合，优选为1:1；添加物中按体积比添加非必需氨基酸的浓度为0.01％-100％，脂质的浓度为0.01％-100％；its的浓度为0.01％-100％；its中包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠，其中，胰岛素含量为0.01-100mg/ml，转铁蛋白含量为0.01-100mg/ml，亚硒酸钠含量为0.01-100μg/ml；人血清白蛋白的浓度为0.01-100mg/ml；胎球蛋白的浓度为0.01-1000μg/ml；ultroser g的浓度为0.01～10％。优选为非必需氨基酸添加1％、脂质添加1％、its添加1％、人血清白蛋白添加1mg/ml、胎牛蛋白添加50μg/ml、ultroserg添加1％。
5、进一步的，所述替代物的制备方法包括以下步骤：
6、(1)收集抗凝牛血进行脱纤维处理：将浸泡氢氧化钠的玻璃珠加入抗凝牛血中，在4～60℃下，1-3000rpm的转速下转动1-120min；其中脱纤维的作用是脱除纤维蛋白原，防止后期配培养基的时候，培养基中的钙盐、镁盐促使凝血。
7、(2)步骤(1)得到的脱纤维牛血经过离心后取上清液；离心后的沉淀重悬后再次离心，取中层沉淀；将第一次离心的上清液和第二次离心的中层沉淀混合后冻融、浓缩处理，得到胎牛血清替代物。离心是去除血细胞，重悬是将沉淀物重新冲洗一遍，二次离心，最大程度留取初血细胞以外的物质。冻融是将牛血中除了血细胞以后的细胞通过冻融破裂细胞膜，释放细胞因子。
8、进一步的，步骤(1)抗凝牛血为向无菌牛血内加入抗凝剂的牛血。所述抗凝剂为肝素钠、edta、枸橼酸钠、氯化钠中的一种或多种；所述无菌牛血为使用无菌针管从牛颈动脉处取血，全程无菌操作得到的牛血。
9、进一步的，步骤(2)中离心步骤的参数为100-10000rpm离心1-120min；再次离心的参数为100-10000rpm离心1-120min。
10、进一步的，步骤(2)中将离心后的沉淀使用1：0.1～10的dhanks液重悬。
11、进一步的，步骤(2)中将混合液于-20～-80℃中反复冻融2～10次。-20℃以下，可以更好的形成冰晶，刺破细胞膜释放细胞因子。反复冻融2-10次是为了充分刺破细胞膜。
12、进一步的，步骤(2)所述的浓缩为将反复冻融的溶液于40～60℃下旋转蒸发浓缩。
13、一种上述胎牛血清替代物的制备方法，将替代物和添加物混合后过膜灭菌、包装即可。优选为过0.22μm滤膜，可以保证无菌。
14、本专利技术得到的胎牛血清替代物颜色呈现浅黄色，澄清透明，其中各组分均为正常市售产品。
15、一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的培养基，包括上述胎牛血清替代物和基础培养基；所述胎牛血清替代物按照体积比1-20％的比例添加至基础培养基中。优选为按照20％的比例添加至基础培养基中。
16、进一步的，所述的基础培养基包括基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素b溶液，其中基础培养基为mem培养基、dmem培养基、dmem/f12培养基、f10培养基中的一种或多种组合。优选为dmem/f12培养基，本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胎牛血清替代物，其特征在于：包括替代物和添加物；其中替代物为抗凝牛血经进行脱纤维处理后，再经离心、重悬、冻融、浓缩处理，得到的产物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂质、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser G。
2.如权利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于：替代物和添加物按照体积比1：0.01～100的比例混合；添加物中按体积比添加非必需氨基酸的浓度为0.01％-100％，脂质的浓度为0.01％-100％；ITS的浓度为0.01％-100％；ITS的浓度为0.01％-100％；人血清白蛋白的浓度为0.01-100mg/mL；胎球蛋白的浓度为0.01-1000μg/mL；Ultroser G的浓度为0.01～10％。
3.如权利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于所述替代物的制备方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步骤(2)中离心步骤的参数为100-10000rpm离心1-120min；再次离心的参数为100-10000rpm离心1-120min。
5.如权利要求3所述的胎牛血
6.如权利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步骤(2)中将混合液于-20～-80℃中反复冻融2～10次；将反复冻融的溶液于40～60℃下旋转蒸发浓缩。
7.一种权利要求1所述的胎牛血清替代物的制备方法，其特征在于：将替代物和添加物混合后过膜灭菌、包装即可。
8.一种用于大黄鱼肌肉干细胞培养的培养基，其特征在于：包括权利要求1所述的胎牛血清替代物和基础培养基，所述胎牛血清替代物按照1-20％的比例添加至基础培养基中。
9.如权利要求8所述的培养基，其特征在于：所述的基础培养基包括基础培养基和青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，其中基础培养基为MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种或多种组合。
10.权利要求8所述的培养基在细胞培养肉中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种胎牛血清替代物，其特征在于：包括替代物和添加物；其中替代物为抗凝牛血经进行脱纤维处理后，再经离心、重悬、冻融、浓缩处理，得到的产物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂质、its、人血清白蛋白、胎球蛋白、ultroser g。
2.如权利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于：替代物和添加物按照体积比1：0.01～100的比例混合；添加物中按体积比添加非必需氨基酸的浓度为0.01％-100％，脂质的浓度为0.01％-100％；its的浓度为0.01％-100％；its的浓度为0.01％-100％；人血清白蛋白的浓度为0.01-100mg/ml；胎球蛋白的浓度为0.01-1000μg/ml；ultroser g的浓度为0.01～10％。
3.如权利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于所述替代物的制备方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步骤(2)中离心步骤的参数为100-10000rpm离心1-120min；再次离心的参数为100-1...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛长湖，殷浩文，郑洪伟，杨鲁，闫晓萌，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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