一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，涉及寄生虫病免疫抗体检测技术领域。其包被原是羊多头蚴基因重组抗原蛋白，酶标记物是酶标抗抗体；酶标抗抗体是羊脑多头蚴病阳性羊血清为一抗，辣根过氧化物酶偶联兔抗羊ＩｇＧ为二抗；羊多头蚴基因重组抗原蛋白，其氨基酸序列为表ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１所示序列，其核苷酸序列为表ＳＥＱＩＤ?ＮＯ：２所示序列；表达重组体是ｐＥＴ－３２ａ－Ｔｍ７重组表达质粒；诊断膜片是包被有包被原的硝酸纤维素膜，阴性对照血清是未患羊脑多头蚴病的阴性对照血清，阳性对照血清是羊脑多头蚴病阳性对照血清，底物溶液是ＤＡＢ缓冲液，洗涤液是ｐＨ７．４ＰＢＳＴ缓冲液；上属液体的均分装在小瓶内，置试剂盒中；人工合成重组抗原，构建了简单、快速的脑多头蚴病诊断方法所需的酶联免疫试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
专利说明本专利技术涉及有蹄动物的脑和脊髓内寄生虫病免疫抗体检测
，尤其涉及针 对羊感染多头蚴的诊断及其检测需要的一种酶联免疫试剂盒。
技术介绍
脑多头蚴病(Coenuriasis)又叫脑包虫病，是由带科的多头带绦虫(Taeniamulticeps)的中绦期幼虫-脑多头蚴(Coenurus cerebralis)寄生于绵羊、山羊、黄牛、牦牛和骆驼等有蹄动物的脑和脊髓等处引起的一种寄生虫病，也偶见有人感染此 病的报道；其成虫寄生于犬、豺、狼和狐狸等的小肠内。本病多发于6 18个月龄的绵羊， 病程缓慢，患病动物多以死亡为转归，给畜牧业造成巨大的经济损失。近年来，血清学诊断技术被应用于脑多头蚴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主 要是多头蚴原头节抗原和囊液抗原等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足实际的 需要。随着分子生物学技术的发展及其在寄生虫学的应用，带科绦虫基因重组抗原已经 成为研究的焦点而且取得了突破性进展，各国学者对用于绦虫蚴病诊断的候选基因作了大 量研究工作。在诊断中，大分子蛋白在不同绦虫间易产生交叉反应，特异性低，因而目前 侧重于低分子量诊断抗原的研究。在猪囊虫病的诊断方面，成功克隆表达了糖蛋白抗原 (LLGP)中的GP50、Tsl4和T24蛋白，8kDa的Ts8Bl和Ts8B2以及IOkDa蛋白；细粒棘球蚴 病上也成功克隆表达出了 AgB2、EpCl、硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)p29等小分子量蛋 白。以上抗原用于诊断，均有较好的敏感性和特异性。本研究借鉴猪囊尾蚴病和细粒棘球蚴病诊断抗原成功克隆表达的经验，通过分子 生物学的方法，人工合成一种可以用于脑多头蚴病诊断的重组抗原，并构建一种简单、快速 的脑多头蚴病诊断方法及其所需的酶联免疫试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，可快速有效的检测羊 多头蚴感染的抗体水平，从分子生物学的角度，为预防、诊断脑包虫病奠定基础。实现本专利技术之目的技术解决方案如下一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，包括试剂盒1内包被着包被原的诊断膜片 1. 1，酶标记物1.2，阴性对照血清1.3，阳性对照血清1.4，底物溶液1. 5，洗涤液1. 6，其特征 是，所述包被原是羊多头蚴基因重组抗原蛋白，所述酶标记物是酶标抗抗体。所述的检测羊多头蚴的基因重组抗原蛋白，其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO 1 所示序列。所述的检测羊多头蚴的基因重组抗原蛋白的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO :2所 示序列。所述的检测羊多头蚴的基因重组抗原蛋白的重组体是pET-32a-Tm7重组表达质粒。所述检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒的酶标抗抗体是羊脑多头蚴病阳性羊血清 为一抗，辣根过氧化物酶偶联兔抗羊IgG为二抗。所述检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒的诊断膜片1. 1是包被有包被原的硝酸纤 维素膜NC，阴性对照血清1. 3是未患羊脑多头蚴病的阴性对照血清，阳性对照血清1. 4是羊 脑多头蚴病阳性对照血清，底物溶液1. 5是DAB缓冲液。洗涤液1. 6 是洗涤缓冲液(pH7. 4PBST,含 0. 05 % Tween-20)由 NaCl 8. 0g、 KC10. 2g、KH2PO4O. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、Tween-200· 5mL 加蒸馏水至 IOOOmL 即成。以上属液体成分的均分装在小瓶内，并置于试剂盒中。依据以上所述的羊多头蚴基因重组抗原蛋白的一种制备方法，其步骤如下(1)从羊脑内采到的多头蚴原头节为原料，提取总RNA，RT-PCR技术扩增出目的基 因的全序列，命名为Tm7基因。(2) PCR产物测序正确后，克隆出目的基因的开放阅读框0RF，将其连接到pMD18_T 载体，转化到大肠杆菌DH5 α后测序，发现克隆到的目的基因的开放阅读框为207bp，编码 68个氨基酸。(3)将此片段亚克隆入pET_32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-Tm7，经转化 大肠杆菌BL21 (DE3)后IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物。(4)将目的蛋白样品过Ni-Charged Resin柱纯化，收集洗脱峰蛋白液，进行电泳 检测，获得纯度很高的目的蛋白即为基因重组抗原蛋白。测序结果表明Tm7基因的全序列为378bp，其中开放阅读框(ORF)为207bp，编 码69个氨基酸，该蛋白分子量约7. BkDa0本次的测序结果已登录到GenBank，登录号为 FJ603044。将该序列进行BlastN比对，它与猪囊尾蚴诊断抗原NC-3基因(AJ012669) 和Ts76基因(AF216696)的相似性均为97% ；与细粒棘球绦虫EpCl基因(AF481884)和 EF-hand基因(AY942148)的相似性均为83%。其ORF与猪带绦虫的NC-3基因的ORF和 Ts76基因序列的部分ORF同源性均高达99. 52%，在35位和152位处发生了 C_T、A_G的转 换，在92位处发生了 C-G的颠换；与细粒棘球绦虫的EpCl基因和EF-hand基因序列的部分 ORF同源性均为85. 99%。与已有技术相比，本专利技术具有显著的优点与积极效果1、本研究利用基因重组方法在大肠杆菌中成功表达Tm7蛋白，表达产物为约 27kDa的融合表达蛋白，并能被羊脑多头蚴病阳性血清识别。表达出的目的蛋白，纯化后能 作为抗原建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白间接ELISA方法，其间接ELISA方法检测 敏感性可达93.3%，特异性达94. 1 %，初步证明Tm7重组蛋白具有作为诊断抗原的特点，而 且本诊断抗原可以进行产业化生产。2、在上述研究基础上建立的一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，简单、有效、快 速，将有效检测绵羊、山羊、黄牛、牦牛和骆驼等有蹄动物的脑和脊髓等处的多头蚴寄生虫 病；在畜牧兽医领域为防止该病的蔓延与发展具有重要意义。附图说明图1本专利技术所述的酶联免疫试剂盒构成图示意图。图2RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定示意图。图3所述目的基因ORF的PCR扩增鉴定图(重组pET32a-Tm7质粒PCR鉴定)。图4重组质粒pET32a-Tm7双酶切鉴定检测凝胶电泳图。图5所述Tm7蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳检测图。图6重组载体菌表达产物与脑多头蚴病阳性羊血清发生反应的免疫印迹图。图7所述的重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析图。图中的数字与字母的含义 图11 试剂盒、1. 1 包被着包被原的诊断膜片、1. 2 酶标记物、1. 3阴性对照血清、 1.4阳性对照血清、1.5底物溶液、1.6洗涤液。图2M :DNA分子量标准DL2000 ； 1，2 重组 pET32a-Tm7质粒PCR鉴定。图3M1，M2 :DNA分子质量标准；1 重组pET32a_Tm7质粒PCR产 物；2，3:EcoR I和Xho I双酶切pET32a-Tm7质粒。图4M 蛋白质分子量标准；1，2 经IPTG 诱导的重组菌；3 未经诱导的重组菌；4 经IPTG诱导的含质粒pET-32a(+)的菌体；5 未 经IPTG诱导的含质粒pET-32a(+)的菌体。图5M 蛋白质分子质量标准；1 未经诱导的重 组菌；2 经IPTG诱导的重组菌；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，包括试剂盒１内包被着包被原的诊断膜片１．１，酶标记物１．２，阴性对照血清１．３，阳性对照血清１．４，底物溶液１．５，洗涤液１．６，其特征是，所述包被原是羊多头蚴基因重组抗原蛋白，所述酶标记物１．２是酶标抗抗体。

【技术特征摘要】
一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，包括试剂盒1内包被着包被原的诊断膜片1.1，酶标记物1.2，阴性对照血清1.3，阳性对照血清1.4，底物溶液1.5，洗涤液1.6，其特征是，所述包被原是羊多头蚴基因重组抗原蛋白，所述酶标记物1.2是酶标抗抗体。2.根据权利要求1所述的检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，其特征是所述的羊多头蚴 基因重组抗原蛋白，其氨基酸序列为序列表SEQID NO 1所示序列。3.根据权利要求1或2所述的检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，其特征是所述的羊多 头蚴基因重组抗原蛋白的核苷酸序列为表SEQID NO 2所示序列。4.根据权利要求1或2所述的检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，其特征是所述基因重 组抗原蛋白的表达载体是pET-32a-Tm7重组表达质粒。5.根据权利要求1所述的检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，其特征是所述酶标抗抗体 是羊脑多头蚴病阳性羊血清为一抗，辣根过氧化物酶偶联兔抗羊IgG为二抗。6.根据权利要求1所述的检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，其特征是所述诊断膜片 1. 1是包被有包被原的硝酸纤维素膜NC，阴性对照血清...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光友，安晓雪，古小彬，彭雪蓉，王淑贤，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]