【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学生物检测，具体地说，是一种适用于组织异位骨化早期筛查、诊断以及治疗的分子标志物spp1及其诊疗应用。
技术介绍
1、异位骨化(heterotopic ossification，ho)是在肌肉、肌腱或其他软组织内形成异位骨的病理过程。目前研究发现，ho主要发生在深度烧伤、骨折、全髋关节置换术等外伤后。同时，ho也是一些罕见遗传性疾病的典型症状，如进行性骨化纤维发育不良和进行性骨性异位增生(poh)。ho危害大，目前尚缺乏有效延缓退变的治疗方式，是全球亟待解决的公共健康问题。因此，深入揭示ho发生发展的关键分子机制对于开发ho的新诊疗方法具有重要的临床意义和社会价值。
2、为此，本专利技术提供了适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物spp1及应用解决上述问题。
技术实现思路
1、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：spp1在异位骨化中的应用，本专利技术的第一方面，提供适用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物：
2、构建小鼠异位骨化模型，分别在术后0，3，7，21天收集手术组织，进行单细胞测序和生物信息学分析,发现间充质干细胞在模型组的数量显著增加，尤其在术后7和21天呈逐渐上升趋势。进一步，对间充质干细胞进行细胞亚群分析，发现col12a1阳性的间充质干细胞细胞比例在术后呈逐渐上升趋势，且在术后第七天达到高峰。对不同群的间充质干细胞进行功能分析，发现col12a1阳性的间充质干细胞与异位骨化的形成密切相关，表达多种成骨分化相关
3、进一步，对正常的后纵韧带组织和骨化的后纵韧带组织进行转录组测序分析，发现骨化的后纵韧带组织spp1的表达显著增加。组织免疫荧光染色也证明了后纵韧带细胞表达integrin受体。同时，对正常的黄韧带和骨化的黄韧带组织进行转录组测序分析同样得到相同的结论：骨化的黄韧带spp1基因表达显著增加，且表达integrin受体。
4、因此，spp1可以作为跟腱，韧带等软组织骨化的一个标志性基因和蛋白，作为用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物。
5、本专利技术的第二方面，提供上述分子标志物spp1在制备异位骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用。
6、优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为跟腱或韧带等软组织检测试剂或检测试剂盒。
7、所述的诊断试剂或试剂盒检测生物样品中spp1的表达量，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
8、优选的，所述的生物样品为跟腱或韧带等软组织。
9、所述的诊断试剂或试剂盒包括：对spp1具有检测特异性的探针、抗体，基因芯片，或pcr引物。
10、优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为采用real-time rt-pcr(q pcr)方法检测spp1表达量的试剂或试剂盒。
11、优选的，所述的对spp1具有检测特异性的物质为pcr引物的核苷酸序列。
12、本专利技术的第三方面，提供一种诊断异位骨化的试剂盒，所述的试剂盒中包括用于检测spp1表达量的试剂。
13、优选的，所述的用于检测spp1表达量的试剂为采用real-timert-pcr方法检测spp1表达量的试剂。
14、优选的，所述的试剂盒中包括：对spp1具有检测特异性的pcr引物的核苷酸序列。
15、本专利技术的第四方面，提供检测spp1表达水平的试剂在制备异位骨化诊断或筛查用试剂盒中的用途。
16、本专利技术的第五方面，提供了利用阻断或降低spp1来维持和/或改善异位骨化的方法：
17、一、构建integrin受体阻断的间充质干细胞和小鼠模型。对于体外实验，在给予间充质干细胞spp1处理的同时加入integrin受体阻断剂(cilengitide,西仑吉肽)，分别检测成骨相关基因(alpl，col1a1，ocn，runx2，ibsp以及sp7)的表达，同时结合alp细胞染色和茜素红染色进一步评估各组细胞成骨能力，发现spp1促进了间充质干细胞成骨的发生，而cilengitide显著缓解了这一效应。细胞荧光染色也进一步明确了基因表达的结果。动物实验也发现，和对照组相比，cilengitide给药组显著缓解了小鼠手术部位的炎症反应和异位骨化的形成。
18、二、所述步骤如下：
19、1.巨噬细胞spp1基因特异性敲除小鼠的设计由江苏集萃药康生物科技股份有限公司辅助完成(合同号gjs072023033051)。
20、2.带有loxp位点的f0代与野生鼠互配获得f1代杂合子。
21、3.f1代杂合子(spp1-flox/+)互配得到f2代纯(spp1--flox/flox)。
22、4.f2代纯合子(spp1-flox/flox)与全身/组织特异性工具鼠交配获得f3代(spp1-flox/+,lyz-cre)。
23、5.f3代(spp1-flox/+,lyz-cre)互配得到f4代(spp1-flox/flox,lyz-cre)，即cko/cki纯合子。
24、6.分别对对照组(spp1-flox/flox)和巨噬细胞spp1基因特异性敲除(lyz-cre；spp1-flox/flox)小鼠构建异位骨化模型，手术2月后取材，分别评估各组手术部位异位骨化发生的情况，发现，巨噬细胞spp1基因特异性敲除(lyz-cre；spp1-flox/flox)小鼠异位骨化发生的程度均较对照组较轻。
25、(三)有益效果
26、本专利技术提供了spp1在异位骨化疾病中的应用。具备以下有益效果：
27、本专利技术可早期筛查异位骨化的患者，以期及早进行干预或预防，最大限度的延缓患者病情进展，降低致残率，本专利技术首次发现了对异位骨化具有较高诊断和治疗价值的分子标记物spp1；通过标志物spp1诊断试剂盒和相关药物的研制和应用，可以使异位骨化的早期诊疗更加方便易行，为临床医生快速并准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础。同时基于抑制spp1细胞内含量显著缓解了间充质干细胞成骨分化，为异位骨化的治疗提供了新的治疗靶点。
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1.适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1，其特征在于：包括分子标志物SPP1，所述分子标志物SPP1可以作为跟腱，韧带等软组织骨化的一个标志性基因和蛋白，作为用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物。
2.适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：提供分子标志物SPP1在制备异位骨化的诊断试剂或试剂盒。
3.根据权利要求2所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的诊断试剂或试剂盒为跟腱或韧带组织检测试剂或检测试剂盒；
4.根据权利要求3所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的生物样品为跟腱或韧带等软组织；
5.根据权利要求4所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的诊断试剂或试剂盒为采用Real-time RT-PCR(q PCR)方法检测SPP1表达量的试剂或试剂盒。
6.根据权利要求5所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的对SPP1具有
7.根据权利要求5所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的试剂盒中包括用于检测SPP1表达量的试剂；
8.根据权利要求5所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物SPP1应用，其特征在于：所述的试剂盒中包括：对SPP1具有检测特异性的PCR引物的核苷酸序列。
...【技术特征摘要】
1.适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物spp1，其特征在于：包括分子标志物spp1，所述分子标志物spp1可以作为跟腱，韧带等软组织骨化的一个标志性基因和蛋白，作为用于异位骨化早期筛查及诊断的分子标志物。
2.适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物spp1应用，其特征在于：提供分子标志物spp1在制备异位骨化的诊断试剂或试剂盒。
3.根据权利要求2所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物spp1应用，其特征在于：所述的诊断试剂或试剂盒为跟腱或韧带组织检测试剂或检测试剂盒；
4.根据权利要求3所述的适用于异位骨化早期筛查及诊疗的分子标志物spp1应用，其特征在于：所述的生物样品为跟腱或韧带等软组织；
5.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙璟川，孙凯强，史建刚，康子健，阎琛，周璇，姜倩倩，于亚萍，范建平，
申请(专利权)人：上海长征医院，
类型：发明
国别省市：
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