【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物，尤其涉及一种海鞘环境dna的检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
1、海鞘(ascidian)是典型的污损生物和入侵物种，典型的种类包括玻璃海鞘、柄海鞘、萨氏海鞘、皮海鞘、皱瘤海鞘和菊海鞘等。这些海鞘无论是在其原生地还是入侵地区都可以快速生长并迅速取代其它物种，是已知的船舶、码头的污损生物，严重影响航运。还有研究表明，玻璃海鞘的入侵还会对水产养殖造成严重影响，它们会占据养殖水产生物如扇贝和牡蛎的养殖绳子或养殖笼，竞争氧气和饵料、污染水产养殖设备和船只，并且还会保留和传输有毒浮游植物的活细胞和包囊，使水产养殖生物大量死亡，从而直接或间接造成巨大的经济损失。因此，海鞘造的生物入侵等安全风险日益受到关注，建立一种快速准确的检测方法对于防治海鞘的入侵具有重要意义，但仅依靠传统调查方法难以获取充足数据，且调查准确度亟待加强。
2、环境dna(edna)检测是近年来兴起的物种检测方法，通过采集水体样本提取环境dna，利用特定分子标记进行水生生物检测，具有对生态环境没有侵入性、采样简单高效、检测灵敏度高、物种鉴定准确等优势。而在使用环境dna检测方法对目标物种进行检测的过程中，如果仅使用单一靶点，就会有难以界定近缘物种的缺点。而对目标物种进行多靶点检测，不仅可以提高目标物种的检出率，还可以提高种间分辨率，研究开发针对目标物种的多个检测靶点，设计短片段扩增引物，筛选可稳定扩增的分子标记，设计高效的多靶点引物混合pcr体系以及多样本混合扩增子文库建立方法，设计快速检测试剂盒，并进一步地研究开发适用于海鞘环境dna
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提出了一种海鞘环境dna的检测方法及其检测试剂盒，本专利技术设计了针对海鞘的3个检测靶点以及对应的3对引物，设计了高效的多靶点引物混合pcr体系，设计了多样本混合扩增子文库建立方法，设计了快速检测试剂盒。其可以快速准确的检测入侵种海鞘，从而及时制定相应的预防政策，减少入侵种海鞘带来的危害。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于海鞘环境dna检测的引物，包括：
3、16s-f：ttacgacctcgatgtcg；
4、16s-r：yycgtyctaaacccarctc；和/或，
5、cox1-f：cdgayatagcttttcctcg；
6、cox1-r：aaatactagavayyctagc；和/或，
7、cytb-f：cgtdvtatwcatrcdaayrgdgctag；
8、cytb-r：caaaaacttatytghcytcaagg。
9、进一步地，所述引物的5’端还标记有样品标签，所述样品标签为标记序列，用于识别不同待测样本。
10、进一步地，所述标记序列包括：
11、
12、本专利技术还提供一种上述的用于海鞘环境dna检测的引物在检测海鞘中的用途。
13、本专利技术还提供一种检测海鞘的方法，包括以下步骤：
14、以待测环境dna样本为模板，利用上述的引物进行pcr扩增；
15、分析扩增产物中有无目标dna片段，判断所述待测环境dna样本中是否存在海鞘。
16、进一步地，所述目标dna片段为海鞘的特异性dna片段。
17、进一步地，所述待测环境dna样本为海水。
18、进一步地，还包括对所述待测环境dna样本进行富集和/或混样的步骤。
19、进一步地，所述pcr扩增的反应体系包括：待测环境dna样本100ng、预混合引物5.5μl、dna聚合酶1μl、buffer mix 25μl，无菌无酶水补足至50μl；
20、其中，所述预混合引物包含cox1引物对2.5μl、16s引物对0.5μl、cytb引物对2.5μl；所述dna聚合酶的反应终浓度为1u；
21、所述pcr扩增的反应条件为：94℃1min，98℃10s、45℃15s、68℃15s，20次循环，98℃10s、50℃15s、68℃15s，15次循环，68℃5min，12℃保存。
22、进一步地，所述分析扩增产物中有无目标dna片段的方法，包括：琼脂糖凝胶电泳和/或荧光染料法。
23、本专利技术还提供一种用于海鞘环境dna检测的试剂盒，包含上述用于海鞘环境dna检测的引物；还包括48孔板、pcrmastermix(2x)、dnaclean beads、end-repair anda-tailingreaction mix、end-repair and a-tailing enzyme mix、adapter for illumina、adapterdilution buffer、adapter-ligation buffer、adapter-ligation enzyme、libraryamplification supermix(2x)、universal primer mix for illumina、libraryelution buffer和nuclease-free water。
24、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和技术效果：
25、本专利技术提供了用于海鞘环境dna检测的引物、多靶点混合pcr体系、多样品混合扩增子文库构建方法、海鞘环境dna检测试剂盒，利用该技术流程对环境dna进行检测，可以检测海水环境dna样品中存在的海鞘种类，方法简单快捷，检测灵敏度高，准确度高。本专利技术为海鞘类入侵生物的防治提供了可靠的理论和技术依据。
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1.一种适用于海鞘环境DNA检测的引物，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的用于海鞘环境DNA检测的引物，其特征在于，所述引物的5’端还标记有样品标签，所述样品标签为标记序列，用于识别不同待测样本。
3.根据权利要求1所述的用于海鞘环境DNA检测的引物，其特征在于，所述标记序列包括：
4.一种权利要求1-3任一项所述的用于海鞘环境DNA检测的引物在检测海鞘中的用途。
5.一种检测海鞘的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目标DNA片段为海鞘的特异性DNA片段。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测环境DNA样本为海水。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括对所述待测环境DNA样本进行富集和/或混样的步骤。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：待测环境DNA样本100ng、预混合引物5.5μL、DNA聚合酶1μL、Buffer Mix 25μL，无菌无酶水补足至50μL；p>
10.一种用于海鞘环境DNA检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的用于海鞘环境DNA检测的引物。
...【技术特征摘要】
1.一种适用于海鞘环境dna检测的引物，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的用于海鞘环境dna检测的引物，其特征在于，所述引物的5’端还标记有样品标签，所述样品标签为标记序列，用于识别不同待测样本。
3.根据权利要求1所述的用于海鞘环境dna检测的引物，其特征在于，所述标记序列包括：
4.一种权利要求1-3任一项所述的用于海鞘环境dna检测的引物在检测海鞘中的用途。
5.一种检测海鞘的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目标dna片段为海鞘的特...
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