【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物学领域，具体涉及杨树良种‘森海2号’根癌农杆菌遗传转化体系的方法建立。
技术介绍
1、杨树良种‘森海2号’是通过中国林科院林业研究所胡建军等人人工控制授粉选育而成，2021年获得良种审定通过的品种(编号：国s-sv-ps-001-2021)。其父本为青杨，母本为美洲黑杨。青杨派和黑杨派的亲缘关系较近，杂交可配性高，是非常优良的杂交组合(胡斌，樊军锋，高建设，等.美洲黑杨与青杨、川杨和卜氏杨人工杂交及杂种苗生长和抗病性状测定[j].浙江林学院学报，2009，26(6)：778-783.)。‘森海2号’具有优良的速生性和材性，但是抗盐碱和抗病虫害能力较差。利用转基因技术对杨树进行遗传改良是重要的手段，但是杨树良种的遗传转化普遍存在转化效率低甚至难以获得转基因植株的问题。
2、农杆菌介导法是目前杨树遗传转化中应用最广泛且结果较为理想、技术较为成熟的一种基因转化方法。它具有操作简便，外源基因拷贝数低，转移dna片段大，可选择的植物组织种类多等优点。通过优化影响农杆菌转化的关键因子，建立杨树良种‘森海2号’根癌农杆菌介导的遗传转化体系对于杨树改良非常必要。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的主要问题是如何提高杨树‘森海2号’的农杆菌介导的遗传转化体系的转化效率。
2、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法。
3、本专利技术提供的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括m1)-m3)：
4、m1
5、m2)培养所述侵染的外植体得到外源基因表达的杨树‘森海2号’转基因植株；
6、m3)培养所述转基因植株完成杨树遗传转化；
7、所述m2)包括如下a1)-a5)步骤：
8、a1)共培养所侵染的外植体，得到共培养的外植体(即表1中侵染外植体数a)；
9、a2)将所述共培养的外植体进行恢复培养，得到恢复培养的外植体；
10、a3)将所述恢复培养的外植体进行分化培养得到抗性丛生芽；
11、a4)将所述抗性丛生芽进行生根培养得到已生出根的杨树幼苗转基因抗性植株(即表1中抗性植株数b)。
12、a5)将所述杨树幼苗转基因抗性植株进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株(即表1中阳性植株数c)。
13、所述侵染为将所述外植体在所述含有农杆菌的侵染培养液的侵染培养基中振荡培养15min，所述侵染培养基为以1/2ms基本培养基为基础培养基，向该基础培养基中添加mes、肌醇、谷氨酰胺、d(+)-半乳糖、as和fv维他命得到的液体培养基，侵染培养基中mes的浓度为0.25g/l，肌醇的浓度为0.1g/l，谷氨酰胺的浓度为0.2g/l，d(+)-半乳糖的浓度为1.8g/l，as的浓度为100μm，fv维他命的浓度为10ml/l；其中所述fv维他命由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为：烟酸浓度为0.1g/l、烟酸吡哆醇浓度为0.1g/l、泛酸钙浓度为0.1g/l、盐酸硫胺浓度为0.1g/l、l-半胱氨酸浓度为0.1g/l和生物素浓度为5ml/l；
14、所述共培养为将所侵染的外植体在共培养基上培养，所述共培养基为以ms基本培养基为基础培养基，向该基础培养基中mes、6-ba、iba、as、琼脂粉得到的固体培养基，共培养基中mes浓度为0.25g/l、6-ba浓度为0.5mg/l、iba浓度为0.25mg/l、as浓度为100μm、溶质为水，琼脂粉浓度为7.0g/l；
15、所述恢复培养为将所述共培养的外植体在恢复培养基上培养，所述恢复培养基为向ms培养基中加入6-ba、zeatin、iba、特美汀、cefotaxime和琼脂粉得到的固体培养基，其中6-ba浓度为0.5mg/l、zeatin浓度为0.25mg/l、iba浓度为25mg/l、timentin浓度为250mg/l、cefotaxime浓度为200mg/l、溶质为水，琼脂粉浓度为7.0g/l；
16、所述分化培养为将所述恢复培养的外植体在分化培养基上培养，所述分化培养基为向ms培养基中加入6-ba、zeatin、iba、timentin、cefotaxime、kanamycin和琼脂粉得到的固体培养基，其中6-ba的浓度为0.5mg/l、zeatin的浓度为0.25mg/l+iba的浓度为0.25mg/l、timentin的浓度为250mg/l、cefotaxime的浓度为200mg/l、kanamycin的浓度为25mg/l、溶质为水，琼脂粉的浓度为7.0g/l；
17、所述生根培养为将所述抗性丛生芽在生根培养基上培养；所述生根培养基为向1/2ms培养基中加入iba、naa、timentin、kanamycin和琼脂粉得到的固体培养基，其中iba浓度为0.05mg/l、naa浓度为0.02mg/l、timentin浓度为250mg/l、kanamycin浓度为25mg/l、溶质为水，琼脂粉浓度为7.0g/l。
18、上述方法中，所述侵染步骤中还包含将所述外植体侵染之前，将所述的农杆菌在侵染培养液中23-24℃活化培养30min的步骤。
19、上述方法中，所述共培养的培养条件在所述共培养基中23-24℃黑暗培养2天。
20、上述方法中，所述恢复培养的培养条件在所述恢复培养基上24-25℃光照培养7天，光照强度1600-2000lux。
21、上述方法中，所述分化培养的培养条件为在所述分化培养基上24-25℃，光照强度1600-2000lux培养4-5周，每8-10天继代一次。
22、上述方法中，所述生根培养的培养条件为在所述生根培养基上24-25℃，光照强度1600-2000lux培养。
23、通过优化影响农杆菌转化的关键因子，建立了杨树良种‘森海2号’根癌农杆菌介导的遗传转化体系，转化效率为2.6％-5.8％(表2)，为‘森海2号’抗逆抗虫害优良新品种的培育提供技术支撑。
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1.根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括M1)和M2)和M3)：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述侵染步骤中，还包含将所述外植体侵染之前，将所述的农杆菌在侵染培养液中23-24℃活化培养30min的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述共培养的培养条件在所述共培养基中23-24℃黑暗培养2天。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述恢复培养的培养条件在所述恢复培养基上24-25℃光照培养7天，光照强度1600-2000lux。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述分化培养的培养条件为在所述分化培养基上24-25℃，光照强度1600-2000lux培养4-5周，每8-10天继代一次。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述生根培养的培养条件为在所述生根培养基上24-25℃，光照强度1600-2000lux培养。
【技术特征摘要】
1.根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括m1)和m2)和m3)：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述侵染步骤中，还包含将所述外植体侵染之前，将所述的农杆菌在侵染培养液中23-24℃活化培养30min的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述共培养的培养条件在所述共培养基中23-24℃黑暗培养2天。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述恢复培养的...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁莉萍，王宏芝，魏建华，陈亚娟，郑林，李思宇，贾海为，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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