【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其是一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针及其使用办法和应用。
技术介绍
1、细胞外囊泡是由细胞分泌的尺寸为30-200nm的囊泡，其膜成分与内含物与细胞具有同源性。越来越多的证据表明细胞外囊泡可以作为癌症诊断的工具，特别是在肿瘤细胞衍生的细胞外囊泡中，一些肿瘤的生物标志物如核酸、蛋白或者生物小分子等在膜内发生富集。以microrna为例且细胞外囊泡膜可以有效地保护microrna不被外界的rnase降解，导致microrna含量与正常细胞衍生的细胞外囊泡不同，因此可以通过定量肿瘤来源细胞外囊泡中的microrna进行疾病的诊断和预后。
2、目前已有多种检测肿瘤细胞外囊泡中microrna的方法。传统的方法是对分离得到的细胞外囊泡进行裂解，提取rna，进行qrt-pcr，但是该方法操作复杂易污染，并且rna容易降解，影响检测的准确性。已报道的其他检测方法，如利用各种力的相互作用、病毒囊泡等进行膜融合递送探针来实现细胞外囊泡内核酸的检测，通过改变细胞外囊泡膜通透性使探针能够进入细胞外囊泡内从而达到检测的目的等。尽管这些方法可以实现细胞外囊泡内核酸的检测，但是这些方法仍存在一些不足，包括膜融合方法操作复杂、改变细胞外囊泡膜通透性容易丢失细胞外囊泡内部的核酸导致准确性较低。因此，需要设计一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针及其使用办法和应用。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的缺陷，提供一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针及其使用
2、本专利技术通过下述方案实现：
3、一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，包括与目标生物标志物互补的互补核酸序列，在所述互补核酸序列上修饰有荧光基团且末端修饰疏水分子，在所述互补核酸序列上还修饰有荧光猝灭基团。
4、所述核酸探针为一个发夹状结构，环状部分为目标生物标志物的互补核酸序列，在所述环状的互补核酸序列的5’端有荧光基团并且末端修饰疏水分子，在所述环状的互补核酸序列的3’端还对应修饰荧光猝灭基团。
5、所述疏水分子包括胆固醇基团。
6、所述目标生物标志物包括细胞外囊泡中的microrna，所述microrna与环状部分的互补核酸序列通过碱基互补形成双链。
7、所述目标生物标志物包括细胞外囊泡中的microrna21。
8、一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针的使用方法，该方法包括以下步骤：所述核酸探针包括与目标生物标志物互补的互补核酸序列，在所述互补核酸序列上修饰有荧光基团且末端修饰疏水分子，在所述互补核酸序列上还修饰有荧光猝灭基团；
9、当核酸探针与细胞外囊泡共孵育时，核酸探针修饰疏水分子的那端插入细胞外囊泡膜，经过相互作用，核酸探针翻转进入细胞外囊泡内，与目标生物标志物形成双链，荧光猝灭基团对荧光发光基团的抑制降低，体系产生荧光信号，通过荧光信号的强度变化即可达到检测目标生物标志物的目的。
10、所述核酸探针为一个发夹状结构，环状部分为目标生物标志物的互补核酸序列，在所述环状的互补核酸序列的5’端有荧光基团并且末端修饰疏水分子，在所述环状的互补核酸序列的3’端还对应修饰荧光猝灭基团，所述核酸探针与细胞外囊泡共孵育的环境温度包括37℃。
11、所述疏水分子包括胆固醇基团，所述目标生物标志物包括细胞外囊泡中的microrna，所述microrna与环状部分的互补核酸序列通过碱基互补形成双链。
12、一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针在制备诊断癌症的诊断剂中的应用，所述核酸探针应用于制备诊断癌症的诊断剂。
13、所述诊断剂应用于定量癌症来源细胞外囊泡中的microrna，进而进行癌症的诊断和预后。
14、本专利技术的有益效果为：
15、1.本专利技术的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针不需要膜融合操作以及避免细胞外囊泡进行修饰与改变的复杂操作，简单快速有效的实现细胞外囊泡中目标microrna的准确定量检测，其便捷性体现在不需要设计其他复杂的链就能达到原位检测目的，且准确性高。
16、2.本申请的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针的使用方法通过简单的操作步骤就可以实现细胞外囊泡内生物标志物的原位快速有效检测。
17、3.本申请的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针可以实现无损检测。检测细胞外囊泡中生物标志物如microrna不用改变细胞外囊泡的生理状态和形态结构，将修饰胆固醇的分子信标与细胞外囊泡37℃共孵育，分子信标插入细胞外囊泡膜上，磷脂双分子层横向流动以及分子相互作用导致分子信标翻转从而原位检测目标microrna。本申请的使用方法递送分子信标的效率较高。
18、4.本申请一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针的使用方法操作简便。该方法操作简单步骤少，为以细胞外囊泡为工具进行癌症的发展机制分析以及诊断提供新的思路与方法借鉴。
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1.一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：包括与目标生物标志物互补的互补核酸序列，在所述互补核酸序列上修饰有荧光基团且末端修饰疏水分子，在所述互补核酸序列上还修饰有荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：所述核酸探针为一个发夹状结构，环状部分为目标生物标志物的互补核酸序列，在所述环状的互补核酸序列的5’端有荧光基团并且末端修饰疏水分子，在所述环状的互补核酸序列的3’端还对应修饰荧光猝灭基团。
3.根据权利要求2所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：所述疏水分子包括胆固醇基团。
4.根据权利要求2所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：所述目标生物标志物包括细胞外囊泡中的microRNA，所述microRNA与环状部分的互补核酸序列通过碱基互补形成双链。
5.根据权利要求4所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：所述目标生物标志物包括细胞外囊泡中的microRNA21。
6.一种如权
7.根据权利要求6所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针的使用方法，其特征在于：所述核酸探针为一个发夹状结构，环状部分为目标生物标志物的互补核酸序列，在所述环状的互补核酸序列的5’端有荧光基团并且末端修饰疏水分子，在所述环状的互补核酸序列的3’端还对应修饰荧光猝灭基团，所述核酸探针与细胞外囊泡共孵育的环境温度包括37℃。
8.根据权利要求6所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针的使用方法，其特征在于：所述疏水分子包括胆固醇基团，所述目标生物标志物包括细胞外囊泡中的microRNA，所述microRNA与环状部分的互补核酸序列通过碱基互补形成双链。
9.一种如权利要求1-5中所述细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针在制备诊断癌症的诊断剂中的应用，其特征在于：所述核酸探针应用于制备诊断癌症的诊断剂。
10.根据权利要求9所述的核酸探针在制备诊断癌症的诊断剂中的应用，其特征在于：所述诊断剂应用于定量癌症来源细胞外囊泡中的microRNA，进而进行癌症的诊断和预后。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：包括与目标生物标志物互补的互补核酸序列，在所述互补核酸序列上修饰有荧光基团且末端修饰疏水分子，在所述互补核酸序列上还修饰有荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：所述核酸探针为一个发夹状结构，环状部分为目标生物标志物的互补核酸序列，在所述环状的互补核酸序列的5’端有荧光基团并且末端修饰疏水分子，在所述环状的互补核酸序列的3’端还对应修饰荧光猝灭基团。
3.根据权利要求2所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：所述疏水分子包括胆固醇基团。
4.根据权利要求2所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：所述目标生物标志物包括细胞外囊泡中的microrna，所述microrna与环状部分的互补核酸序列通过碱基互补形成双链。
5.根据权利要求4所述的一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针，其特征在于：所述目标生物标志物包括细胞外囊泡中的microrna21。
6.一种如权利要求1-5中所述细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针的使用方法，其特征在于，该方法包括以下步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏飞，周菲，潘莉，夏青，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：
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