【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物组织工程的，具体涉及一种3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法。
技术介绍
1、目前我国糖尿病(dm)发病率逐年提高，糖尿病足溃疡(dfu)是其最主要并发症之一。创面愈合初期受到炎症、缺血、感染以及氧化应激影响，其逐渐转为慢性难愈合创面，若不及时治疗会导致截肢乃至死亡。现阶段针对糖尿病创面的治疗，临床上常采用多种新型湿性敷料对创面进行分段治疗的方法，如藻酸盐敷料、薄膜敷料和水凝胶敷料相结合等。如果患者皮肤缺失较为严重，则需进行人工植皮。尽管以上治疗手段取得一定成效，但皮肤代替物价格昂贵，效果有限。
2、3d生物打印为解决临床缺少皮肤代替物提供强大的技术支持，它应用生物墨水负载活细胞、核酸和生长因子等，逐层打印，精确构建所需的皮肤组织，并可保持较高的细胞活性。然而寻找适合的生物墨水是3d生物打印常面临的主要挑战。理想的生物墨水需要同时满足良好的打印性(快速固化能力)，合适的力学支撑性，优良的生物相容性和优异的生物活性。虽然已经有部分研究利用明胶和胶原等合成生物墨水在体外构建皮肤支架。在打印性方面，现有生物墨水仍然存在注射能力差，固化速度慢，力学强度低和降解性能不可控等缺点；在生物活性方面，现有生物墨水生物活性较低，无法为细胞提供与体内ecm相似的微环境，营养物质供应不足，细胞增殖和组织新生有限，导致与创面新生组织整合较弱，未能显著促进创面。由于缺乏同时具有良好打印和生物活性的生物墨水，导致3d打印皮肤支架仍存在挑战。脱细胞基质可为细胞提供与体内ecm相似的微环境，促进细胞增殖迁移，但是其成型
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水制备方法，该制备方法工艺简单、制备成本低；所制备的复合生物墨水具有细胞外基质成分，具有优良的生物相容性和生物活性，三维细胞培养活性高具有正常的生物学功能；应用在3d生物打印领域，其打印性良好，保证打印后的仿生三维结构精度高，力学强度可控性强，能够精确的模拟细胞生长的三维微环境。
2、本专利技术实现其专利技术目的所采用的技术方案是：
3、一种3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
4、(a)gelma海绵的制备：将明胶溶于d-pbs中，在50℃水浴搅拌至样品完全溶解，用1mol/l的naoh溶液调节溶液ph至7.5-8.0，恒定速度加入甲基丙烯酸酐，避光水浴透析6d，冻干48h得gelma海绵；
5、(b)猪脱细胞真皮基质制备：将新鲜猪皮组织预处理后，剪碎处理，0.25％胰蛋白酶浸泡6h后用去离子水洗涤3次，加入70％乙醇浸泡10-12h，再加入3％h202浸泡15min，去离子水洗涤1次，接着加入1％triton x-100/0.26％edta/0.69％tris混合溶液浸泡20h后洗净，冻干72h制成猪脱细胞真皮基质；
6、(c)丙酮光引发剂混合溶液配制：用丙酮完全溶解光引发剂，配制成丙酮光引发剂混合溶液；
7、(d)复合生物墨水配制：将步骤(a)gelma海绵加于pbs缓冲液中，适宜温度下搅拌充分溶解，将步骤(b)猪脱细胞真皮基质缓慢加入，将步骤(c)丙酮光引发剂混合溶液缓慢加入，最终使gelma浓度为0.125g/ml,猪脱细胞真皮基质浓度为0.015-0.03g/ml，经调节ph及灭菌后即可得。
8、作为优选的，在上述的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法中：步骤a所述的恒定速度为0.5ml/min加入甲基丙烯酸酐。
9、作为优选的，在上述的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法中：步骤(b)所述的新鲜猪皮预处理方法为-80℃和37℃冻融循环5次。
10、作为优选的，在上述的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法中：步骤(c)所述的光引发剂为光引发剂184和光引发剂819。
11、作为优选的，在上述的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法中：步骤(d)所述的适宜温度为50℃，调节ph为6.8-7.5。
12、作为优选的，在上述的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法中：步骤(d)其特征在于所述ph调节方法为：将复合生物墨水置于冰上，边快速搅拌边逐滴滴加1mol/l的naoh溶液。
13、本专利技术的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的使用方法是：
14、将配制好的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水倒入打印料筒中，将打印筒固定在3d打印机喷头，安装内径为0.27mm的打印针头，设置3d打印机参数，进行无菌打印；打印后的支架模型用365nm蓝光照射固化交联成型，放入-40℃冰箱冰冻，去离浸泡清洗除去光引发剂，真空冷冻干燥，保存备用。
15、本专利技术制备得到的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水打印性良好，交联后结构稳定性高，且材料来源于广泛，生物安全性和生物相容性高，制备方法简单，成本低廉。与现有材料和技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
16、1、本专利技术制备的脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水所使用的材料来源均为动物，制备条件温和，制备过程无毒无害，且生物墨水保留了组织细胞真实细胞外基质成分、结构、性能和相关理化因子，具有较好的生物降解性、生物相容性和生物活性；
17、2、打印后的生物墨水能够在365nm蓝光照射下，30秒内快速交联成型，打印性能较好，且蓝光对细胞的伤害较小，满足载细胞3d生物打印要求；
18、3、通过调配脱细胞外基质的比例，不影响复合生物墨的打印性，可以有效的调节打印后三位载细胞模型的力学强度和生物活性，满足不同性能组织的模型构建。
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1.一种3D打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的3D打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(A)所述的恒定速度为0.5mL/min。
3.根据权利要求1所述的3D打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(B)所述的新鲜猪皮预处理方法为-80℃和37℃冻融循环5次。
4.根据权利要求1所述的3D打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(C)所述的光引发剂为光引发剂184和光引发剂819。
5.根据权利要求1所述的3D打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(D)所述的适宜温度为50℃，调节pH为6.8-7.5。
6.根据权利要求6所述的3D打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于所述pH调节方法为：将复合生物墨水置于冰上，边快速搅拌边逐滴滴加1mol/L的NaOH溶液。
7.根据权利要求1所述3D打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的使用方法，其特征
...【技术特征摘要】
1.一种3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述的恒定速度为0.5ml/min。
3.根据权利要求1所述的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(b)所述的新鲜猪皮预处理方法为-80℃和37℃冻融循环5次。
4.根据权利要求1所述的3d打印脱细胞真皮基质皮肤支架生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(c)所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李恭驰，李炳辉，张晨晨，邓海波，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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