【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种靶向敲除stat1基因的sgrna和敲除stat1基因的猪肾细胞系及其应用。
技术介绍
1、crispr/cas是一种细菌防御入侵的适应性免疫系统，它识别来自噬菌体或质粒的入侵核酸，并通过cas9核酸酶切割rna或dna以消除感染。crispr/cas9是一种简单、快速的工具，可以对各种物种和细胞类型的内源基因进行高效修饰。sgrna(shortguided rna)是crispr/cas9系统的重要组成部分，由crispr衍生rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)两部分组成。部分crrna序列与tracrrna同源，crrna可以通过碱基配对与tracrrna结合形成tracrrna/crrna复合物。该复合体引导cas9核酸酶定位到待编辑的dna序列附近。cas9核酸酶作为一种rna导向的dsrna结合蛋白，是已知的第一个能够将rna、dna和蛋白质共定位的统一因子，显示出巨大的创造潜力。crispr/cas9系统已成功应用于多种物种，包括斑马鱼、小鼠和大鼠。此外，该技术对动物物种没有限制，在大豆、烟草、水稻、小麦等植物基因改造方面也取得了突破。然而，sgrna脱靶是影响crispr/cas敲除效率低的主要原因，因此寻找特异性好、高效的靶点是技术成功的关键。
2、stat1(signal transducers and activators of transcriptionare 1)作为stats家族的重要成员，通常由免疫细胞中i型ifn诱导。stat的生物
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种高效、易操作、重复性强的靶向敲除stat1基因的sgrna，解决了现有技术中抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默基因表达的问题，同时首次获得了stat1基因缺失猪肾细胞株系，是理想的stat1基因敲除的pk-15细胞模型，为深入研究stat1蛋白功能和在猪瘟病毒感染致病机制中的作用奠定基础。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供一种靶向敲除stat1基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq idno.1和seq id no.2所示。
4、本专利技术还提供了所述的sgrna在敲除stat1基因中的应用。
5、本专利技术还提供了一种含有所述sgrna的表达盒。
6、本专利技术还提供了一种含有所述sgrna的表达载体。
7、本专利技术还提供了所述表达载体的构建方法，包括以下步骤：
8、(1)在seq id no.1的5'端加上核苷酸序列为cacc的酶切位点和一个g，得到seqid no.3；
9、(2)在seq id no.2的5'端加上核苷酸序列为aaac的酶切位点，3'端加上c，得到seq id no.4；
10、(3)将seq id no.3和seq id no.4退火，形成双链dna分子；
11、(4)将px459载体酶切后与双链dna分子进行连接，得到表达载体px459-stat1。
12、本专利技术还提供了所述sgrna在构建stat1基因缺失细胞株系中的应用。
13、本专利技术还提供了所述stat1基因缺失细胞株系的构建方法，包括如下步骤：培养细胞至70～80％融合度时，将含有表达载体px459-stat1的混合液转染进细胞中并培养。
14、作为优选，所述培养的温度为35～39℃，培养的时间为12～16h。
15、本专利技术还提供了一种stat1基因缺失细胞株系。
16、本专利技术还提供了一种用于stat1基因敲除试剂盒，包括如下(1)～(4)中的任意一种：
17、(1)权利要求1所述的sgrna的核苷酸序列；
18、(2)权利要求3所述的表达盒；
19、(3)权利要求4所述的表达载体；
20、(4)权利要求9所述的stat1基因缺失细胞株系。
21、本专利技术提供了一种高效、特异性强、操作简单的靶向敲除stat1基因的sgrna及其应用。所述敲除stat1基因的sgrna的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，stat1基因敲除效率达到82.4％。本专利技术首次得到stat1基因敲除的猪肾细胞系，利用crispr-cas9系统从猪肾细胞中敲除stat1基因，有效改进了抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默基因表达的缺点，敲除效果更加彻底。本专利技术在不引入任何外源基因的情况下进行基因修饰，获得的基因敲除细胞系可作为体外研究猪瘟病毒致病机制的模型，同时为深入挖掘stat1基因在猪瘟病毒复制与转录过程中的作用研究提供基础。
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1.一种靶向敲除STAT1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的sgRNA在敲除STAT1基因中的应用。
3.一种含有权利要求1所述sgRNA的表达盒。
4.一种含有权利要求1所述sgRNA的表达载体。
5.一种权利要求4所述表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.权利要求1所述sgRNA在构建STAT1基因缺失细胞株系中的应用。
7.一种STAT1基因缺失细胞株系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：培养细胞至70～80％融合度时，将含有表达载体PX459-STAT1的混合液转染进细胞中并培养。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述培养的温度为35～39℃，培养的时间为12～16h。
9.一种STAT1基因缺失细胞株系，其特征在于，所述细胞株系由权利要求7～8任一项构建方法获得。
10.一种用于STAT1基因敲除试剂盒，其特征在于，包括如下(1)～(4)中
...【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除stat1基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq idno.1和seq id no.2所示。
2.权利要求1所述的sgrna在敲除stat1基因中的应用。
3.一种含有权利要求1所述sgrna的表达盒。
4.一种含有权利要求1所述sgrna的表达载体。
5.一种权利要求4所述表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.权利要求1所述sgrna在构建stat1基因缺失细胞株系中的应用。
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