【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，尤其涉及高产棕榈油酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、棕榈油酸(palmitoleic acid，c16:1δ9)是一种碳链长度为16的单不饱和脂肪酸，依据其双键位置分类为一种omega-7脂肪酸。棕榈油酸作为一种特殊脂肪酸，具有多种功能应用。自20世纪以来，慢性病(如肥胖、心血管疾病)的增加对人类健康构成了重大威胁。许多研究将这些疾病与不健康的饮食联系在一起，主要是指过度摄入糖、蛋白质和脂肪等大量营养素。最近的研究证明，棕榈油酸是人体脂肪酸的关键指标，可能与多种疾病的产生有着密切联系，包括肥胖、心血管疾病和脂肪肝等。在制药领域，它还被广泛用作预防中风的抗血栓药物。由于其抑制黑色素生成的能力，它通常也会用于皮肤洁面剂，并有潜力作为一种有效的皮肤美白剂。
2、目前，棕榈油酸的合成主要是依赖于植物合成以及微藻生产。但是，采用植物生产棕榈油酸有许多不利因素。首先，这些植物都需要较为特殊的气候条件，同时巨大场地费用以及漫长的生长周期为种植带来不可控因素，例如气候变化，人工因素等。而另一种生产手段微藻，同样面临许多难题，微藻的基因操作较为困难，代谢改造提升空间不大，同时微藻油脂提取以及成本费用也是工业化生产面临的困境。相比植物提取法而言，微生物发酵法生长周期短且可全天候生产、同时产油微生物含油量高且生物量大，因此用产油微生物来生产棕榈油酸是一种经济高效的方式。但是，现有技术中，缺乏能够高效生产棕榈油酸的微生物。
技术实现思路
1、本专
2、本专利技术再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法高效，操作简单。
3、本专利技术的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌在生产棕榈油酸中的应用。
4、高产棕榈油酸的重组解脂耶氏酵母菌，是在解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)基因组中敲除过氧化物酶体生物发生因子10和三酰基甘油脂肪酶4，并且插入了乙酰辅酶a羧化酶、δ9去饱和酶、乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶基因表达盒后所得。
5、在本专利技术中，所述乙酰辅酶a羧化酶基因来源于解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)；δ9去饱和酶是将来自秀丽隐杆线虫的基因经密码子优化后所得；甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶是将沙棘果(sea buckthorn)来源的基因经密码子优化后所得。
6、在本专利技术中，所述δ9去饱和酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶的基因序列依次如seq id no.1-5所示。
7、在本专利技术中，所述δ9去饱和酶、乙酰辅酶a羧化酶、乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶基因表达盒在解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)基因组中整合的位点依次为：a08位点、inta、dgat2、gpat、lpaat、pdat。
8、在本专利技术中，所述表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的tef启动子、hp4d启动子、tefin启动子、pox2启动子或gpdin启动子中的任意一种；所述终止子为解脂耶氏酵母的xpr2t终止子、mig1t终止子、lip2t终止子中的任意一种。
9、在本专利技术中，所述重组解脂耶氏酵母菌基因组中pelo1启动子位点和/或pscd启动子位点还插入了内源的铜离子抑制启动子pctr1。
10、在本专利技术中，将各基因表达盒通过同源重组方法插入基因组中，将待敲除基因通过同源重组方法敲除。
11、本专利技术还提供所述重组解脂耶氏酵母菌在制备棕榈油酸中的应用。
12、在本专利技术中，将所述重组解脂耶氏酵母菌采用如下发酵培养基发酵制备棕榈油酸：葡萄糖130-170g/l、硫酸铵10-12g/l、酵母提取物2.5-3.5g/l、玉米蛋白胨0.085-0.105g/l、磷酸二氢钾3.5-4.5g/l、硫酸镁1.8-2.2g/l、硫酸钙0.78-0.82g/l、氯化钠0.35-0.45g/l、盐酸硫铵10-14mg/l、生物素0.85-1.15mg/l、钼酸钠140-180mg/l、硫酸铜0.18-0.22mg/l、硼酸38-42mg/l、硫酸锰160-200mg/l、氯化亚铁70-80mg/l。
13、在本专利技术中，发酵过程中补入葡萄糖。
14、有益效果：本专利技术重组解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)是基于敲除了负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母，使其同源重组能力增强，通过解脂耶氏酵母自身的同源重组功能实现基因的整合，能大幅度提高导入基因的遗传稳定性。该重组解脂耶氏酵母构建方法高效，操作简单。本专利技术重组解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)敲除了过氧化物酶体生物发生因子10(pex10位点)和三酰基甘油脂肪酶4，过表达秀丽隐杆线虫δ9去饱和酶、乙酰辅酶a羧化酶、异源乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、异源甘油-3-磷酸酰基转移酶、异源溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、异源磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶，试验证明该重组解脂耶氏酵母能够高效发酵生产棕榈油酸，实现了植物来源天然产物棕榈油酸在解脂耶氏酵母中的高效合成。
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1.高产棕榈油酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于是在解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)基因组中敲除过氧化物酶体生物发生因子10和三酰基甘油脂肪酶4，并且插入了乙酰辅酶A羧化酶、Δ9去饱和酶、乙酰辅酶A二酰甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶基因表达盒后所得。
2.根据权利要求1所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述乙酰辅酶A羧化酶基因来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；Δ9去饱和酶是将来自秀丽隐杆线虫的基因经密码子优化后所得；甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、乙酰辅酶A二酰甘油酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶是将沙棘果(Sea buckthorn)来源的基因经密码子优化后所得。
3.根据权利要求1或2所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述Δ9去饱和酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、乙酰辅酶A二酰甘油酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶的基因序列依次如SEQ ID No：1-5所示。
<...【技术特征摘要】
1.高产棕榈油酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于是在解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)基因组中敲除过氧化物酶体生物发生因子10和三酰基甘油脂肪酶4，并且插入了乙酰辅酶a羧化酶、δ9去饱和酶、乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶基因表达盒后所得。
2.根据权利要求1所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述乙酰辅酶a羧化酶基因来源于解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)；δ9去饱和酶是将来自秀丽隐杆线虫的基因经密码子优化后所得；甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶是将沙棘果(sea buckthorn)来源的基因经密码子优化后所得。
3.根据权利要求1或2所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述δ9去饱和酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶的基因序列依次如seq id no：1-5所示。
4.根据权利要求3所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述δ9去饱和酶、乙酰辅酶a羧化酶、乙酰辅酶a二酰甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、磷脂酰胆碱：二酰基甘油酰基转移酶基因表达盒在解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)基因组中整合的位点依次为：a08位点、inta、dgat2、gpat、lpaat、...
【专利技术属性】
技术研发人员：纪晓俊，周昱帆，王凯峰，林璐，黄和，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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