本发明专利技术属于动物模型构建和临床基因功能检测分析技术领域，具体涉及一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法。本发明专利技术在kif7突变遗传背景的斑马鱼基因组中插入en2a‑eGFP DNA片段，使突变体转基因斑马鱼的中间快肌纤维可以特异性高表达en2a‑eGFP融合蛋白；通过分别注射hKIF7和mu‑hKIF7的mRNA，量化分析中快肌纤维细胞数量，统计hKIF7和各遗传变异体的回复效率值，按不同类型致病阈值判定临床不明意义突变的致病性。本发明专利技术能对KIF7意义不明的遗传变异体进行快速准确的评价，有助于初极纤毛相关信号通路的机制研究，为相关疾病的诊断治疗提供了更多的科学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物模型构建和临床基因功能检测分析，具体涉及一种检测kif7遗传变异潜在致病性的方法。
技术介绍
1、纤毛是特化于细胞表面、基于微管结构的天线状细胞器，在细胞运动、细胞信号感知和传导中发挥重要作用。纤毛结构和功能的异常会导致一系列相关疾病的产生。其中，纤毛蛋白突变阻碍的纤毛发育会使胚胎在发育早期致死或畸形。kinesin7(kif7)属于驱动蛋白4家族，是一个纤毛定位蛋白。
2、近年来研究发现，kif7突变会导致包括joubert综合征(joubert syndrome)、脑积水(hydrolethalus syndrome)和肢端胼胝体综合征(acrocallosal syndrome)等在内的多种发育缺陷疾病，这些疾病的共性表型有多指、视网膜退化、内脏反位和精神发育迟缓等。这一类疾病属于基因突变遗传病，目前没有有效的干预方法，因此孕早期诊断和预防是主要的临床手段。
3、随着新一代测序技术在单基因病的致病突变研究和医疗实践中的广泛应用，目前各个基因突变的数据已出现快速增长。临床数据显示，截止2022年底，各种方式发现的hkif7突变有超过700多个，其中引起单个氨基酸变化的错义突变占比90％。然而，除了无义突变和移码突变这些比较容易确定为功能缺失型遗传变异外，仅有不到80个突变具有明确的功能解释和临床指导意义，而绝大部分的错义突变功能不明，临床意义不明，这成为kif7功能缺失相关疾病的早期诊断和遗传咨询干预瓶颈。因此，建立可以快速检测kif7错义突变功能变化和临床指导意义的方法迫在眉睫。</p>4、目前针对kif7遗传变异功能的分析尚没有快速、统一的方案。而对于其他特定基因功能分析常见的方法多数是基于细胞系建立的，具有成本高、检测方案繁琐的问题，但最主要的问题是由于个体的复杂性，遗传变异导致的功能变化在个体水平和细胞水平表现度呈现很大的不同，因此细胞水平的证据临床参考价值不高。
5、基于目前针对kif7蛋白的功能研究显示，其主要功能是作为重要的组分调控脊椎动物hedgehog(hh)通路信号的转导，而其突变最主要的表型是导致hh通路活性异常。斑马鱼在研究hh通路信号转导分子机制方面有着独特的优势。斑马鱼基因engrailed2a(en2a)是其肌肉组织中中间快肌纤维(mff)的特征基因，而该蛋白的表达是依赖于hh通路活性的，因此可以作为特异的报告基因指示hh通路的活性。
6、研究发现，当kif7基因缺失后，斑马鱼en2a表达量上调，mff数量增加，而这种异常表型可以通过补充kif7 mrna而有效回复，这具有检测hkif7遗传变异功能的潜力。此外，斑马鱼具有个体小、繁殖率高、生长周期短、胚胎透明、与人类基因的同源性高、适于高通量筛选、易于基因操作等优势，最重要的是以斑马鱼的检测体系是建立在个体水平的检测体系。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，我们利用斑马鱼这种模式动物来建立有效的kif7功能回复验证的方法和平台，提供了一种基于斑马鱼kif7缺失突变功能回复检测kif7遗传变异潜在致病性的方法，从而实现对kif7意义不明的遗传变异体进行快速准确的评价，为相关疾病的诊断治疗提供更多的科学依据。
2、为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现：
3、一种检测kif7遗传变异潜在致病性的方法，具体步骤如下：
4、(1)获得斑马鱼驱动蛋白kif7基因序列，如seq id no.1所示；针对其第一个外显子设计基因打靶引导rna，构建并筛选获得斑马鱼kif7基因敲除纯合突变体；
5、(2)通过gibson组装的方法构建minitol2-en2a-egfp转基因表达载体，其序列如seq id no.6所示；建立基因组中携带en2a-egfp的稳定转基因品系tg(en2a:egfp)；
6、(3)tg品系与步骤1获得的kif7基因敲除纯合突变体经两次杂交，筛选获得tg(en2a:egfp)；kif7-/-实验材料；
7、(4)应用gibson组装的方法建立人kif7融合egfp的表达载体pcs2+-hkif7-gfp；根据数据库资源筛选hkif7已知致病突变和临床意义不明确的错义突变，利用定点突变的方法构建突变hkif7融合egfp的表达载体pcs2+-mu-hkif7-gfp；
8、(5)将步骤(4)中获得的hkif7和mu-hkif7表达载体，经体外转录获得其mrna，将这些mrna分别导入步骤(3)所获得的tg(en2a:egfp)；kif7-/-斑马鱼品系，根据量化mff数量反映回复效率，判定临床意义不明kif7错义突变的致病性。
9、进一步地，步骤(1)中所述构建并筛选获得斑马鱼kif7基因敲除纯合突变体的具体步骤如下：
10、(1)以pdr274载体为模板，通过pcr扩增获得grna的dna产物，其中斑马鱼kif7的靶序列为ggaagtggcggtcatt，其引物序列如下，
11、seq id no.2：
12、taatacgactcactataggaagtggcggtcattgcccgttttagagct agaaatagc
13、seq id no.3：aaaagcaccgactcggtgccac；
14、(2)将步骤(1)中dna产物回收，然后作为模板体外转录，获得grna；
15、(3)将上述grna与cas9蛋白混合，显微注射到野生型斑马鱼一细胞期胚胎中，培养至成鱼，即为t0代；
16、(4)待t0代斑马鱼性成熟后，分别使之与野生型斑马鱼测交，获得t1代；
17、(5)随机选择t1代胚胎数枚提取其基因组基因，通过pcr扩增联合测序方法进行基因型鉴定，引物序列如下，
18、seq id no.4：ctatgtctccaaaaggagtcgg
19、seq id no.5：agtgtacacctcctcctgggta；
20、(6)将鉴定成功的t1代kif7+/-杂合斑马鱼按突变类型分开培养至性成熟后自交，获得的子代养2-3个月后进行基因型鉴定，鉴定方法同步骤(5)，最终获得kif7基因敲除纯合突变体。
21、优选的，所述grna终浓度为1ug/ul，cas9蛋白终浓度为5um。
22、进一步地，所述步骤(3)中tg(en2a:egfp)；kif7-/-实验材料制备的具体步骤为：
23、(1)以斑马鱼cdna和minitol2-egfp载体作为模板，通过pcr扩增分别获得斑马鱼en2a上游启动子序列以及载体minitol2-egfp，引物序列分别为，
24、seq id no.7：gtgagcaagggcgaggagctgt
25、seq id no.8：atttaaattaaactgggcatc
26、seq id no.9：ccatgtg本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，步骤(1)中所述构建并筛选获得斑马鱼kif7基因敲除纯合突变体的具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，步骤(3)中所述gRNA终浓度为1ug/uL，Cas9蛋白终浓度为5uM。
4.根据权利要求1所述的一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中Tg(en2a:eGFP)；kif7-/-实验材料制备的具体步骤为：
5.根据权利要求4所述的一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，步骤(3)中所述minitol2-en2a-eGFP转基因表达载体和tol2 mRNA的工作浓度分别为30ng/μL和50ng/μL。
6.根据权利要求1所述的一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，步骤(4)中所述获得表达载体pCS2+-hKIF7-GFP和pCS2+-mu-hKIF7-GFP的具体步骤为：
7.根据权利要求1所述的一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，步骤(5)中所述判定临床意义不明KIF7错义突变致病性的具体步骤为：
8.根据权利要求7所述的一种检测KIF7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，步骤(1)中所述显微注射的统一量为300pg。
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【技术特征摘要】
1.一种检测kif7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种检测kif7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，步骤(1)中所述构建并筛选获得斑马鱼kif7基因敲除纯合突变体的具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的一种检测kif7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，步骤(3)中所述grna终浓度为1ug/ul，cas9蛋白终浓度为5um。
4.根据权利要求1所述的一种检测kif7遗传变异潜在致病性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中tg(en2a:egfp)；kif7-/-实验材料制备的具体步骤为：
5.根据权利要求4所述的一种检测kif7遗传变异潜在致病性...
【专利技术属性】
技术研发人员：张宏宇，赵仲华，刘妤菲，薛文佳，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：
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