【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于猪肠病毒抗体制备领域，尤其涉及一种猪肠病毒g型plp蛋白多克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
1、猪肠病毒g型(ev-g)是一种在猪群中广泛存在的病原体，在欧洲、美洲、亚洲存在流行。ev-g感染仔猪可引发其体重增长减缓、腹泻、皮肤或神经症状，同时研究表明该病毒还具有广泛的组织噬性及细胞噬性，对我国生猪养殖及仔猪健康具有一定威胁的同时，还存在着跨物种传播的风险。
2、近年来，美洲、亚洲、欧洲等地的多个国家和地区报道了ev-g基因组与源于猪环曲病毒(ptov)的木瓜样蛋白酶(plp)基因自然重组的现象。该现象的一种重组方式是在猪肠病毒g型基因组2c/3a位置发现有插入与ptov plp基因高度同源的外源基因。plp插入后，与2c以及3a蛋白连接处各存在1个3c蛋白酶切割位点，从而保证了plp能从多聚蛋白中切割下来发挥功能并且不影响病毒自身蛋白的加工过程。
3、目前，ev-g的诊断方法主要依靠病原分离、分子诊断以及血清学检测。病原分离作为病毒检测的“金标准”同样常用于猪肠病毒g型。一般来说，通过将样品处理后接种于培养的细胞进行病毒的扩增培养，连续传代后常通过典型的细胞病变效应(cpe)、电镜观察病毒粒子形态或者免疫荧光(if)进行结果鉴定。然而，目前市场上缺乏特异性识别自然重组猪肠病毒g型plp蛋白的特异性抗体，无法对该类型病毒进行特异性识别。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种猪肠病毒g型plp蛋白多克隆抗体的制备方法及其应
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、猪肠病毒g型plp蛋白多克隆抗体的制备方法，将自然重组猪肠病毒g型全长plp基因(plp)或截短plp基因(plp-1)克隆至原核表达载体pet-32a获得重组质粒pet-32a-plp或pet-32a-plp-1；将重组质粒经诱导表达、纯化获得重组蛋白；将重组蛋白免疫兔子，获得得到抗plp兔源多克隆抗体或抗plp-1兔源多克隆抗体。
4、全长plp基因和截短plp基因分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列；所得重组蛋白分别具有序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4的氨基酸序列。
5、上述制备方法，包括以下步骤：
6、(1)将猪肠病毒g型的plp基因连接至空载体，构建重组质粒并进行测序鉴定；
7、(2)将步骤(1)中的重组质粒转导进入感受态细胞，扩大诱导表达收集重组蛋白并纯化；
8、(3)以纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，分离出血清后获得特异性识别自然重组猪肠病毒g型的多克隆抗体。
9、步骤(1)按以下进行操作：
10、a、将自然重组猪肠病毒g型接种至marc-145细胞，收集样品提取rna反转录后获得cdna；
11、b、以a中得到的cdna为模板，通过pcr分别扩增猪肠病毒g型的全长plp基因(plp)或截短plp基因(plp-1)片段；
12、c、对扩增的基因片段进行回收；
13、d、对回收片段和空载体分别进行双酶切，回收酶切产物；
14、e、利用t4连接酶配置体系在16℃条件下进行过夜连接，分别将目的片段连接至pet-32a载体；
15、f、连接产物转化至dh5α感受态细胞，挑取单个菌落后进行菌液pcr鉴定，阳性克隆扩大培养后提取质粒进行测序鉴定，获得重组质粒pet-32a-plp以及pet-32a-plp-1。
16、步骤(1)b中，扩增全长plp基因所使用的引物为seq.id.no.5和seq.id.no.6，扩增截短plp基因所使用的引物为seq.id.no.7和seq.id.no.8。
17、步骤(1)b中pcr扩增的程序是：98℃，2min，之后98℃，15s，58℃，15s，72℃，80s重复32个循环，最后72℃，10min，4℃保存样品。
18、步骤(2)按以下进行操作：将重组质粒pet-32a-plp和pet-32a-plp-1转化至bl21(de3)感受态细胞，挑取筛选单个阳性克隆，5ml菌液扩大培养至500ml含有氨苄青霉素的lb培养基中，37℃、200rpm/min条件下培养至菌液od600在0.6左右，加入iptg至终浓度为0.8mmol/l，接着在16℃、200rpm/min条件下培养10h；收集菌体后进行超声破碎，4℃10000rpm/min条件下基因10min，plp重组蛋白在沉淀中收集，plp-1重组蛋白在上清中获得，再利用ni-nta琼脂糖树脂分别对两种重组蛋白进行纯化即可。
19、步骤(3)按以下进行操作：分别将纯化后的重组plp蛋白或重组plp-1蛋白与弗氏佐剂混合作为抗原免疫至新西兰大白兔，首次免疫后再进行两次加强免疫，收集并分离兔子血清，获得对应的多克隆抗体。
20、上述制备方法所得猪肠病毒g型plp蛋白多克隆抗体。
21、上述猪肠病毒g型plp蛋白多克隆抗体在制备特异性识别自然重组猪肠病毒g型或其plp蛋白的药物中的应用。
22、针对自然重组猪肠病毒g型及其plp蛋白鉴定检测存在的问题，专利技术人建立了一种猪肠病毒g型plp蛋白多克隆抗体的制备方法，将自然重组猪肠病毒g型全长plp基因(plp)或截短plp基因(plp-1)克隆至原核表达载体pet-32a获得重组质粒pet-32a-plp或pet-32a-plp-1；将重组质粒经诱导表达、纯化获得重组蛋白；将重组蛋白免疫兔子，获得得到抗plp兔源多克隆抗体或抗plp-1兔源多克隆抗体。结果表明，本专利技术制备的多克隆抗体效价均达到了1:128000，并且能够通过ifa试验特异性识别自然重组猪肠病毒g型的plp蛋白。因此，本专利技术可用于特异性识别自然重组猪肠病毒g型或其plp蛋白，为后续自然重组plp基因猪肠病毒g型的病原鉴定、疾病检测以及病毒生物学功能研究奠定了基础。
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1.一种猪肠病毒G型PLP蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将自然重组猪肠病毒G型全长PLP基因或截短PLP基因克隆至原核表达载体pET-32a获得重组质粒pET-32a-PLP或pET-32a-PLP-1；将重组质粒经诱导表达、纯化获得重组蛋白；将重组蛋白免疫兔子，获得得到抗PLP兔源多克隆抗体或抗PLP-1兔源多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述全长PLP基因和截短PLP基因分别具有序列表SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列；所得重组蛋白分别具有序列表SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)按以下进行操作：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(1)b中，扩增全长PLP基因所使用的引物为SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6，扩增截短PLP基因所使用的引物为SEQ.ID.NO.7和SEQ.ID.NO.8。
6.根
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(2)按以下进行操作：将重组质粒pET-32a-PLP和pET-32a-PLP-1转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取筛选单个阳性克隆，5mL菌液扩大培养至500mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200rpm/min条件下培养至菌液OD600在0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，接着在16℃、200rpm/min条件下培养10h；收集菌体后进行超声破碎，4℃10000rpm/min条件下基因10min，PLP重组蛋白在沉淀中收集，PLP-1重组蛋白在上清中获得，再利用Ni-NTA琼脂糖树脂分别对两种重组蛋白进行纯化即可。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(3)按以下进行操作：分别将纯化后的重组PLP蛋白或重组PLP-1蛋白与弗氏佐剂混合作为抗原免疫至新西兰大白兔，首次免疫后再进行两次加强免疫，收集并分离兔子血清，获得对应的多克隆抗体。
9.权利要求1至8任一制备方法所得猪肠病毒G型PLP蛋白多克隆抗体。
10.权利要求9所述猪肠病毒G型PLP蛋白多克隆抗体在制备特异性识别自然重组猪肠病毒G型或其PLP蛋白的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种猪肠病毒g型plp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将自然重组猪肠病毒g型全长plp基因或截短plp基因克隆至原核表达载体pet-32a获得重组质粒pet-32a-plp或pet-32a-plp-1；将重组质粒经诱导表达、纯化获得重组蛋白；将重组蛋白免疫兔子，获得得到抗plp兔源多克隆抗体或抗plp-1兔源多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述全长plp基因和截短plp基因分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列；所得重组蛋白分别具有序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)按以下进行操作：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(1)b中，扩增全长plp基因所使用的引物为seq.id.no.5和seq.id.no.6，扩增截短plp基因所使用的引物为seq.id.no.7和seq.id.no.8。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(1)b中pcr扩增的程序是：98℃，2min，之后98℃，15s，58℃，15s，72℃，80s...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳康，洪大林，曾令佑，陈凯歌，张胜斌，覃一峰，尹业师，何家康，陈樱，韦祖樟，黄伟坚，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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