【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，具体而言，涉及一种软枣猕猴桃的组织培养方法及其在软枣猕猴桃遗传转化中的应用。
技术介绍
1、软枣猕猴桃果实是一种珍稀的、天然的、绿色的可食用浆果，因其潜在的营养价值和商用价值，是一种世界珍稀的、纯天然的、绿色的可食用浆果，是极具有开发前景的第三代水果之一。人们对软枣猕猴桃的需求在不断的增加，虽然东北有部分地区己经有相对较规范的种植基地，但是在目前优质品种缺乏的情况下，软枣猕猴桃的产量依旧是供不应求，价格也是居高不下。因此，深入研究软枣猕猴桃的快速繁殖，将会对其产业发展起到较大的推动作用，从而缓解供应不足的现象。另外，随着种植面积的增加，软枣猕猴桃缺少优良品系、环境适应性不强，及果实不耐贮藏等问题严重影响了产业的发展。
2、农杆菌介导的遗传转化对于猕猴桃品种改良具有重要意义，相较于传统的育种方式，它具有时效快，操作简单等优势。目前在国内外的研究中，已有关于软枣猕猴桃遗传转化的相关报道。但大部分的研究都是利用原生质体培养，通过peg介导法进行遗传转化。目前将叶片作为外植体，通过农杆菌介导法进行遗传转化的研究在猕猴桃上有较少的研究，但在软枣猕猴桃中较为罕见。在其他植物研究中，以叶片作为侵染材料，利用农杆菌介导法侵染叶片，诱导不定芽再生获得阳性植株这种方法存在转化困难、转化效率低等问题，且不同品种之间反应有差异。因此，提供一种适用于不同基因型且转化效率高的软枣猕猴桃最佳转化体系具有重要意义。
3、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
2、本专利技术是这样实现的：
3、一方面，本专利技术提供了一种软枣猕猴桃的组织培养方法，其包括：以软枣猕猴桃的成龄叶片作为外植体，依次进行愈伤组织诱导、丛生芽分化诱导以及生根诱导培养；
4、成龄叶片为叶龄为20-30天的叶片。
5、在一些实施例中，上述愈伤组织诱导所采用的培养基组分包括ms(含蔗糖)+0.5mg/l naa+0.1-0.4mg/l 6-ba+0.1-0.4mg/l kt；
6、丛生芽分化诱导所采用的培养基组分包括ms(含蔗糖)+3.0mg/l 6-ba+0.1mg/lnaa+0.5-1.5mg/l kt+0.5g/l lh；
7、生根诱导培养所采用的培养基组分包括ms(含蔗糖)+0.2-0.8mg/l iba。
8、在一些实施例中，愈伤组织诱导、丛生芽分化诱导以及生根诱导培养的培养温度为24-26℃。
9、另一方面，本专利技术提供了上述软枣猕猴桃的组织培养方法在软枣猕猴桃的遗传转化中的应用。
10、在一些实施例中，软枣猕猴桃的遗传转化步骤包括：待转化的外植体与含有目的基因的侵染液混合后，将浸染了浸染液的外植体接种到筛选培养基和丛生苗再生培养基中，得到再生植株，然后对获得的再生植株进行抗性鉴定；
11、外植体包括采用上述软枣猕猴桃的组织培养方法获得的培养10-12天的愈伤组织。
12、在一些实施例中，筛选培养基的组分包括：ms(含蔗糖)+2mg/l 6-ba+0.2mg/l naa+0.5g/l lh+0.4mg/l草铵膦+抗生素，其培养条件为：在24-26℃的黑暗条件下，培养7天，转至光下培养，培养25d；
13、其中，抗生素为侵染液中含有的农杆菌转入的目的质粒携带的抗性基因对应的抗生素。
14、在一些实施例中，丛生苗再生培养基的组分包括：ms(含蔗糖)+3.0mg/l 6-ba+0.1mg/l naa+0.5-1.5mg/l kt+0.5g/l lh，其培养条件为：在24-26℃的黑暗条件下，培养3天，转至光下培养，每30天继代一次，直至分化成完整植株。
15、在一些实施例中，外植体还包括培养6-8天的成熟叶片和茎段；成熟叶片和茎段在进行浸染前还包括将其进行预培养，然后依次接种到共培养基、洗脱培养基和愈伤组织再生培养基中，获得愈伤组织；
16、成熟叶片为叶龄为20-30天的叶片；茎段为半木质化茎段。
17、在一些实施例中，成熟叶片和茎段在进行浸染前的预培养的培养基组分包括：ms+0.5mg/l naa+0.2mg/l6-ba+0.4mg/l kt；预培养的培养条件为：在24-26℃的黑暗条件下，培养3天；
18、在一些实施例中，共培养基的组分包括：ms(含蔗糖)+0.5mg/l naa+0.2mg/l6-ba+0.4mg/l kt，其培养条件为：在24-26℃的黑暗条件下，共培养3-5天；
19、洗脱培养基的组分包括：ms(含蔗糖)+抗生素；
20、愈伤组织再生培养基的组分包括：ms(含蔗糖)+0.5mg/l naa+0.2mg/l6-ba+0.4mg/l kt+抗生素，其培养条件为：在24-26℃的黑暗条件下，培养4天，转至光下培养，培养25d。
21、在一些实施例中，在进行共培养前，将成熟叶片沿着叶片切割为0.5cm×0.5cm的叶盘；或将茎段切割为2cm的单芽茎段。
22、本专利技术具有以下有益效果：
23、本专利技术提供一种利用软枣猕猴桃的成熟叶片进行植物再生及遗传转化的方法，该方法与用其他外植体进行组培快繁获取再生植株相比，其成活率高。本专利技术不仅为软枣猕猴桃提供了一种快速繁殖生产技术，同时利用这个再生方法进行遗传转化，也可以提高遗传转化的成功率，具有良好的应用前景。
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1.一种软枣猕猴桃的组织培养方法，其特征在于，包括：以软枣猕猴桃的成龄叶片作为外植体，依次进行愈伤组织诱导、丛生芽分化诱导以及生根诱导培养；
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导所采用的培养基组分包括MS(含蔗糖)+0.5mg/L NAA+0.1-0.4mg/L6-BA+0.1-0.4mg/L KT；
3.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导、丛生芽分化诱导以及生根诱导培养的培养温度为24-26℃。
4.如权利要求1-3任一项所述的软枣猕猴桃的组织培养方法在软枣猕猴桃的遗传转化中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述软枣猕猴桃的遗传转化步骤包括：待转化的外植体与含有目的基因的侵染液混合后，将浸染了浸染液的外植体接种到筛选培养基和丛生苗再生培养基中，得到再生植株，然后对获得的再生植株进行抗性鉴定；
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述筛选培养基的组分包括：MS(含蔗糖)+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L LH+0.
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述丛生苗再生培养基的组分包括：MS(含蔗糖)+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5-1.5mg/LKT+0.5g/L LH，其培养条件为：在24-26℃的黑暗条件下，培养3天，转至光下培养，每30天继代一次，直至分化成完整植株。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述外植体还包括培养6-8天的成熟叶片和茎段；所述成熟叶片和茎段在进行浸染前还包括将其进行预培养，然后依次接种到共培养基、洗脱培养基和愈伤组织再生培养基中，获得愈伤组织；
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述成熟叶片和茎段在进行浸染前的预培养的培养基组分包括：MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L6-BA+0.4mg/L KT；所述预培养的培养条件为：在24-26℃的黑暗条件下，培养3天；
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在进行共培养前，将所述成熟叶片沿着叶片切割为0.5cm×0.5cm的叶盘；或将所述茎段切割为2cm的单芽茎段。
...【技术特征摘要】
1.一种软枣猕猴桃的组织培养方法，其特征在于，包括：以软枣猕猴桃的成龄叶片作为外植体，依次进行愈伤组织诱导、丛生芽分化诱导以及生根诱导培养；
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导所采用的培养基组分包括ms(含蔗糖)+0.5mg/l naa+0.1-0.4mg/l6-ba+0.1-0.4mg/l kt；
3.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导、丛生芽分化诱导以及生根诱导培养的培养温度为24-26℃。
4.如权利要求1-3任一项所述的软枣猕猴桃的组织培养方法在软枣猕猴桃的遗传转化中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述软枣猕猴桃的遗传转化步骤包括：待转化的外植体与含有目的基因的侵染液混合后，将浸染了浸染液的外植体接种到筛选培养基和丛生苗再生培养基中，得到再生植株，然后对获得的再生植株进行抗性鉴定；
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述筛选培养基的组分包括：ms(含蔗糖)+2mg/l 6-ba+0.2mg/l naa+0.5g/l lh+0.4mg/l草铵膦+抗生素，其培...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙丹，曹馨文，艾军，耿佳麒，石广丽，王振兴，陈帅明，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：
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