一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法技术

一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法属兽药含量测定、药代动力学及残留规律领域；１ｍＬ血浆样品加４ｍＬ乙腈和０．３ｇ氯化钠，混合后离心，上清液用氮气吹干，残留物以１∶９比例加３ｍＬ甲醇－５ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵，于Ｃ１８固相萃取柱净化；采用液相色谱－质谱联用仪按以下条件分析：电喷雾离子化方式，氮气喷雾压力４９ｐｓｉ，喷雾电压４８００Ｖ，氩气压力２０ｐｓｉ，温度３００℃，Ｓｏｕｒｃｅ?ＣＩＤ－１２Ｖ。ｍ／ｚ?５３６；全扫描方式检测ｍ／ｚ为５３６的碎片离子；流动相组成：乙腈∶０．５ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵＝８５∶１５，流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎ，柱温２０℃；本发明专利技术具有快速、灵敏、检测限低的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽药含量测定及药代动力学研究领域，涉及一种兽药在生物样品中测 定含量的方法，尤其涉及一种测定动物血浆中米尔贝肟含量的方法及样品前处理方法。
技术介绍
米尔贝肟是大环内酯类抗体内外寄生虫药物，是米尔贝霉素A3和A4的肟衍生物， 主要通过增强虫体的抑制性神经递质Y “氨基丁酸的释放使虫体麻痹死亡，通常用来预防 恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。1997年，我国台湾地区推出台湾 诺华股份有限公司生产的以米尔贝肟为主要成分的倍脉心，作为犬猫预防心丝虫与肠内寄 生虫内服药，是米尔贝肟首次在中国应用。由于米尔贝肟对体内外寄生虫均有很好的驱杀 作用，并对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，其应用和研究越来越受到重视。现用于大环内酯类抗寄生虫药物检测的方法有薄层层析法、免疫化学法和高效液 相色谱法，其中薄层层析法主要用于伊维菌素在牛粪便中的降解评价，实验操作繁琐、耗 时，且荧光衍生物易降解；免疫化学方法存在较强的交叉反应性；高效液相色谱法因其高 分离能力而占有很大优势，在大环内酯类抗寄生虫药物检测中的应用越来越广泛，其中包 括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测等，紫外检测因为灵敏度不够高，而主要用于药物含 量较高的样品；荧光检测器检测涉及到衍生化，虽然衍生化方法越来越成熟，由最初的用十 个小时的反应时间，到现在的几十秒钟，衍生化产物的稳定性也有所提高，但因米尔贝肟5 位有肟基团，有多个共轭二烯结构，衍生化产物复杂，不利于检测，且该法检测下限仅达能 达到0. 5μ g/mL，远远达不到血浆样品低含量检测的需要；尤其在药代动力学、药物残留规 律研究中，生物样品如血浆、组织中的药物浓度极微量情况下，上述测定方法难以满足检测 要求；而LC-MS/MS是以质谱为检测手段的色谱技术，它集液相色谱的高分离能力和质谱的 高灵敏度和高选择性于一体，在药物的定量分析中占有很大的优势。但目前尚无该法用于 动物血浆中米尔贝肟的含量测定。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有用于检测动物血浆中米尔贝肟含量技术存在的问题，研究提 供一种用于动物血浆中米尔贝肟的含量测定LC-MS/MS方法，具有简单快速、灵敏度高、检 测限低的特点。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定LC-MS/MS方法，血浆样品进行如下处理 ImL血浆样品加入4mL乙腈和0. 3g氯化钠，在微型混合器上充分涡旋lmin，以3500r/min 离心5min，取上清于尖底玻璃离心管中，50°C氮气流下吹干，残留物按1 9比例加3mL甲 醇-5mmol/L乙酸铵，涡旋混勻，于C18固相萃取柱进行纯化；依次用3mL甲醇、3mL水活化 萃取小柱，加入上样液，用2mL水冲洗，再用3mL 10 90体积比的甲醇-5mmol/L乙酸铵和 3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，50°C氮气流下吹干，残渣用ImL流动相溶解，过0. 22 μ m微孔尼龙膜，取5 μ L进样，采用液相色谱_质谱联用仪按以下色谱条件进行LC-MS/MS分析离子化方式为电喷雾条件，氮气喷雾压力49psi，喷雾电压4800V，氩气压力 20psi，温度300°C，Source CID-12V。米尔贝肟检测的m/z为536。全扫描方式检测m/z为 536的碎片离子；流动相组成乙腈0. 5mmol/L乙酸铵=85 15，流速0. 25mL/min，柱温 20°C。所述的生物样品优选为犬血浆。本专利技术具有以下优点1.专属性强本专利技术经空白血浆样品和含药血浆样品的LC-MS/MS分析，可见血浆 中米尔贝肟的A3和A4分离良好，无内源性物质干扰，证明该法对血浆中米尔贝肟的检测专 属性强；2.标准曲线回归性好，定量限低本专利技术经线性范围与血浆标准曲线测定试验， 证明米尔贝肟在2 500ng/mL范围内，浓度与响应比呈良好的线性关系，犬血浆样品工作 曲线为y = 94. 2379x-60. 4477，r = 0. 999551，定量限为5ng/mL，能够满足于低含量药物的 检测；3.基质效应小本专利技术在试验中证明，米尔贝肟在5. 0,150. 0,400. 0ng/mL3种浓 度在Beagle犬血浆中的基质抑制率均小于17%，在质谱检测要求范围内；4.精密度和准确度高本专利技术在试验中证明，米尔贝肟在5. 0,150. 0,400. Ong/mL 3种浓度测定的批内和批间RSD%均在5%之内，血浆样本的分析方法符合有关规范要求；5.稳定性好本专利技术在试验中证明，米尔贝肟血浆样品冰冻放置六个月后，所有 样品的准确度绝对值均小于15%，表明长期冰冻放置血浆样品，不影响本方法对样品浓度 进行准确测定；血浆样品室温放置12h后测定，所有样品的准确度绝对值均小于15%，说明分析 测试过程中的样品较为稳定；血浆样品经反复冻融3次，每一冻融周期超过24h，与未经冻融的样品进行对比， 所有样品的准确度绝对值均小于15%，说明反复冻融血浆样品，不影响本方法对样品浓度 进行准确测定。附图说明图1米尔贝肟A3扫描质谱2米尔贝肟A4扫描质谱3米尔贝肟标准品色谱4空白血浆色谱5血浆添加米尔贝肟标准品色谱6待测样品色谱7米尔贝肟血浆样品标准曲线图具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术。实施例1本专利技术动物血浆中米尔贝肟含量LC-MS/MS测定方法的建立1.标准溶液的配制称取0. 5mg米尔贝肟标准品，置于IOOmL容量瓶中，用乙腈定容 至刻度，配制成相当于米尔贝肟5 μ g/mL的标准储备液。根据试验需要，用流动相稀释至所 需浓度的标准工作液，用于绘制标准曲线。标准储备液和标准工作液均在_20°C保存；2.血浆样品前处理ImL血浆样品加入4mL乙腈和0. 3g氯化钠，在微型混合器上 充分涡旋lmin，以3500r/min离心5min，取上清于尖底玻璃离心管中，50°C氮气流下吹干， 残留物按1 9比例加3mL甲醇-5mmol/L乙酸铵，涡旋混勻，于C18固相萃取柱进行纯化。 依次用3mL甲醇、3mL水活化萃取小柱，加入上样液，用2mL水冲洗，再用3mL 10 90体积 比的甲醇-5mmol/L乙酸铵和3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，50°C氮气流下吹干，残渣用ImL流 动相溶解，过0. 22 μ m微孔尼龙膜，取5 μ L进样，进行LC/MS/MS分析；3.检测仪器及分析条件美国Firmigan公司TSQ Quantum型液相色谱-质谱联用 仪即LC-MS/MS，由Finnigan Surveyor LC泵、Surveyor AS自动进样器、电喷雾离子化电离 源及三极串联质谱组成。控制软件为X caliber 1. 4，质谱数据分析采用LcqUan2. 0数据处 理系统；LC-MS/MS分析条件离子化方式为ESI电喷雾条件，氮气喷雾压力49psi，喷雾电 压4800V，氩气压力20psi，温度300°C，Source CID-12V。米尔贝肟检测的m/z为536。全 扫描方式检测m/z为536的碎片离子；流动相组成乙腈0.5mmol/L乙酸铵=85 15， 流速 0. 25mL/min,柱温 20 °C ；4.线性范围与血浆标准曲线测定取犬空白血浆lmL，依次加入米尔贝肟标准液 0. ImL,配制成相当于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法，其特征在于血浆样品进行如下处理：１ｍＬ血浆样品加入４ｍＬ乙腈和０．３ｇ氯化钠，在微型混合器上充分涡旋１ｍｉｎ，以３５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清于尖底玻璃离心管中，５０℃氮气流下吹干，残留物按１∶９比例加３ｍＬ甲醇－５ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵，涡旋混匀，于Ｃ１８固相萃取柱进行纯化；依次用３ｍＬ甲醇、３ｍＬ水活化萃取小柱，加入上样液，用２ｍＬ水冲洗，再用３ｍＬ－１０∶９０体积比的甲醇－５ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵和３ｍＬ甲醇洗脱，收集洗脱液，５０℃氮气流下吹干，残渣用１ｍＬ流动相溶解，过０．２２μｍ微孔尼龙膜，取５μＬ进样，采用液相色谱－质谱联用仪按以下色谱条件进行ＬＣＭＳ／ＭＳ分析：离子化方式为电喷雾条件，氮气喷雾压力４９ｐｓｉ，喷雾电压４８００Ｖ，氩气压力２０ｐｓｉ，温度３００℃，ＳｏｕｒｃｅＣＩＤ－１２Ｖ；米尔贝肟检测的ｍ／ｚ为５３６；全扫描方式检测ｍ／ｚ为５３６的碎片离子；流动相组成：乙腈∶０．５ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵＝８５∶１５，流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎ，柱温２０℃。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李继昌，徐倩倩，向文胜，刘永，曲明丽，张耀藤，于晓蕾，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]