【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于简便、迅速且以高灵敏度检测作为甲氧西林耐药性的特异性遗传元件的meca基因的引物对、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，以下简称为“mrsa”)是全世界院内感染的主要致病菌，在许多国家作为最主要的临床耐药菌而受到重视。作为与mrsa的甲氧西林耐药性相关的基因的meca编码pbp(青霉素结合蛋白，penicillin binding protein)-2’(也被称为pbp-2a)。通常，金黄色葡萄球菌主要产生4种pbp。pbp是参与细胞壁的肽多糖合成的蛋白，具有转肽酶活性。β-内酰胺类抗生素通过与pbp的活性部位结合从而抑制转肽酶活性、抑制肽多糖合成来发挥作用。但是，pbp-2’通过降低与β-内酰胺类抗生素的亲和性来避免抑制肽多糖合成的效果(非专利文献1)。
2、对于金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌而言，有无甲氧西林耐药性在感染患者的诊断和治疗方针的确定中是非常重要的信息。虽然金黄色葡萄球菌的病原性强，因此较之其他凝固酶阴性葡萄球菌而言更受重视，但是对于获得了甲氧西林耐药性的金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌而言，对易感宿主的感染还是大问题。因此，作为应对甲氧西林耐药性葡萄球菌的院内感染的对策，一直以来期望甲氧西林耐药性的迅速检测，以实现迅速的诊断、治疗。
3、作为测试甲氧西林耐药性的方法，可实施药物敏感性试验、免疫分析、利用pcr(聚合酶链式反应，polymerase cha
4、在药物敏感性试验中，需要将从患者采集的血液培养一天以上来增加葡萄球菌。另外，免疫分析也需要培养葡萄球菌的工序，因此，直至能得到甲氧西林耐药性试验的结果为止需要一天以上。
5、与上述相比，pcr等核酸扩增检查的灵敏度非常高，因此无需培养的过程，能够利用患者血液直接进行试验。因此，能够在患者血液检体到达后数小时内提交试验结果(专利文献1)。
6、现有技术文献
7、专利文献
8、专利文献1：国际公开第2007/097323号
9、非专利文献1：journal of bacteriology,may 1980p.275
10、非专利文献2：journal of clinical microbiology,july 1992,p.1685
技术实现思路
1、专利技术所要解决的课题
2、虽然已报道了数种利用pcr等核酸扩增检测甲氧西林耐药性基因的方法，但多数报道没有明确记载具体的检测灵敏度。仅有报道虽然明确记载了检测灵敏度、但并未达成足以在临床现场使用的检测灵敏度(非专利文献2)。
3、另一方面，甲氧西林耐药性基因的检测对于患者的诊断、治疗方针影响较大，因此开发迅速、正确且可靠地进行检测的方法是临床上的当务之急。因此，本专利技术将迅速、正确且可靠地检测甲氧西林耐药性基因作为课题。尤其将提供用于实现灵敏度高的甲氧西林耐药性基因检测的引物对作为课题。
4、用于解决课题的手段
5、本专利技术是通过使用核酸扩增方法来从患者检体直接迅速地鉴定甲氧西林耐药性基因、并且以比以往方法更高的检测灵敏度可靠地进行检测的方法。本申请专利技术人以确立高灵敏度且迅速的甲氧西林耐药性基因的检测方法为目标，着眼于pcr法。尤其是为了以高灵敏度检测甲氧西林耐药性基因，针对pcr法中使用的引物进行了研究。
6、设计引物使用如下条件。
7、在不降低扩增效率的范围内，增加被扩增的dna片段的大小。具体而言，dna片段的大小设为150bp以上且700bp以下。通过增加被扩增的dna片段的大小，使得pcr反应时的扩增曲线的荧光强度提高，熔解分析(melting analysis)中得到的峰的高度也变高。
8、验证meca同源物(homologue)的序列，仅在保守性高的部分设计引物对的碱基序列。具体而言，排除在自引物的3’末端起5个碱基以内包含保守性低的序列的情况，修正碱基序列使其成为保守性高的序列。
9、基于上述理念，制备特定的fwd、及rev引物各32条，将它们进行组合，制备认为可行的313个引物对，从其中研究最合适的组合，从而筛选出能达成比作为在先申请的专利文献1更高的检测灵敏度的引物对。
10、即，本专利技术涉及的引物对为用于检测meca基因(甲氧西林耐药性基因)的引物对，其特征在于，
11、所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的1个引物对，
12、(a)包含序列号3和序列号7的组合、序列号2和序列号9的组合、序列号1和序列号8的组合、序列号1和序列号9的组合、序列号4和序列号11的组合、序列号5和序列号12的组合、序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
13、(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1～2个碱基而得到的引物对；
14、(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
15、本专利技术涉及的meca基因检测试剂盒的特征在于包含选自由上述的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对。
16、本专利技术涉及的检体中的meca的检测方法的特征在于具有下述工序：
17、pcr工序，使用从检体制备的dna、和用于扩增dna的引物对实施pcr；和
18、通过检测利用所述pcr工序得到的扩增产物中的meca基因、或通过分析所述扩增产物，来实施所述检体中的meca基因的检测的工序，
19、所述pcr工序中使用的引物对为选自由上述的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对。
20、本申请涉及下述项：
21、1、用于检测meca基因的引物对，其是用于检测meca基因(甲氧西林耐药性基因)的引物对，
22、其特征在于，所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的1个引物对，
23、(a)包含序列号3和序列号7的组合、序列号2和序列号9的组合、序列号1和序列号8的组合、序列号1和序列号9的组合、序列号4和序列号11的组合、序列号5和序列号12的组合、序列号6和序列号10的组合或序列号6和序列号12的组合的引物对；
24、(b)所述(a)中，针对一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；
25、(c)包含与所述(a)或(b)的碱基序列对应的互补序列的引物对。
26、2、如项1所述的引物对，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测mecA基因的引物对，其是用于检测mecA基因(甲氧西林耐药性基因)的引物对，
2.如权利要求1所述的引物对，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
3.包含引物对的mecA基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对，
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其包含用于PCR的酶、用于PCR的试剂及用于PCR的器具中的至少1种。
6.选自由以下的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对在检体中的mecA基因的检测试剂盒的制造中的用途，所述检测包括：
7.如权利要求6所述的用途，其中，所述引物对为包含序列
...【技术特征摘要】
1.用于检测meca基因的引物对，其是用于检测meca基因(甲氧西林耐药性基因)的引物对，
2.如权利要求1所述的引物对，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对。
3.包含引物对的meca基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物对为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的至少1个引物对，
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述引物对为包含序列号6和序列号10的组合的引物对、或针对该组合中的一条或两条...
【专利技术属性】
技术研发人员：天野仰，远藤绚子，矢内久阳，辻健太郎，森重敬，
申请(专利权)人：三井化学株式会社，
类型：发明
国别省市：
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