【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，涉及一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，尤其涉及一种解析藜麦叶片盐囊泡不同发育时期特征的高通量单细胞蛋白组学方法。
技术介绍
1、藜麦(chenopodium quinoa willd.，2n＝4×＝36)是苋科(amaranthaceae)藜属(chenopodium)一年生双子叶植物，原产于南美洲安第斯山脉。藜麦富含蛋白质、维生素和矿物质等营养成分，被联合国粮食组织(fao)认为是唯一一种可满足人类基本营养需求的植物。国际营养学家称其为最适宜人类的完美“营养黄金”和“超级谷物”。藜麦是盐生植物，可耐受较高的盐浓度(150mm nacl～750mm nacl)，生长的最佳盐度条件为100～200mmnacl。藜麦米正逐渐成为全球最重要的粮食作物之一。
2、全球藜麦种质资源丰富，大约有250个种，有报道的藜麦品种(材料)有5 000余份。然而，目前缺乏对不同藜麦材料的营养价值、重要农艺性状调控机理，以及种植、栽培、加工工艺等的深入研究。2016年以来，藜麦kd品种近交系与藜麦栽培品种real近交系的全基因组测序相继完成，藜麦高质量的染色体水平参考基因组序列也已经公布，这些藜麦基因组信息为深入研究藜麦重要农艺性状的分子调控机理进而开展分子模块设计育种奠定了基础。
3、藜麦叶片表面大量分布一种特化的单细胞结构——盐囊泡细胞(epidermalbladder cell，ebc)，这可能跟藜麦的耐盐性有关。盐囊泡细胞、柄细胞(stalk cell，sc)和表皮细胞(epiderma
4、藜麦叶片表面的盐囊泡数量众多且处于不同的发育时期，目前还没有建立对不同发育时期盐囊泡定义和分离的方法，盐囊泡调控离子稳态、渗透平衡、代谢物积累的特殊分子机制也并不清楚。与藜麦盐囊泡相似，番杏科(aizoaceae)日中花属(mesembryanthemum)盐生植物冰叶日中花(mesembryanthemum crystallinum l.)叶片表面也具有大量的盐囊泡结构。曾有报道，可以利用刀片刮液氮冷冻后的叶片盐囊泡，或者利用胰岛素针抽取盐囊泡的细胞液，从而获取盐囊泡的成分。然而，刀片刮取的方法容易混入叶肉细胞和其它表皮细胞成分，胰岛素针抽取的方法只能获得盐囊泡细胞液，无法获得完整盐囊泡细胞结构。因此，这些方法都不能被借鉴用于开展藜麦盐囊泡相关研究。
5、单细胞蛋白质组学技术是高通量精准解析细胞功能特异性的最新技术之一。在植物中开展单细胞蛋白质组学研究的最大技术瓶颈是如何获取特定的植物单细胞。受到现有高分辨质谱的扫描速度和检测灵敏度的限制，目前只能搜集大量植物特有类型的单细胞，如花粉、卵细胞、气孔保卫细胞、叶肉细胞、表皮毛、根毛等，开展植物单细胞类型(singlecell type)蛋白质组学研究。然而，获取这些植物细胞的过程中，经常利用纤维素酶、果胶酶等酶解细胞壁，这往往会造成植物细胞结构和功能的改变，从而导致无法真实反映植物单细胞的蛋白质组学特征。另一方面，上述植物单细胞类型蛋白质组学研究中使用的蛋白质分离(如：双向电泳、高效液相色谱)、鉴定方法(利用分辨率相对较低的质谱)的分析通量和灵敏度较低，无法实现高通量单细胞蛋白质组学分析。例如，已有研究利用双向电泳、非标记定量等方法，在冰叶日中花盐囊泡中鉴定出了50余种丰度差异蛋白质，这很难解析盐囊泡发育及其在盐逆境应答过程中复杂的分子调控机制。
技术实现思路
1、鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何定义藜麦叶片盐囊泡发育时期，如何实现高通量盐囊泡单细胞蛋白质组学分析。本专利技术提供一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，确定了藜麦叶片盐囊泡的不同发育时期，简化了快速大量获取完整藜麦盐囊泡细胞的方法，建立了盐囊泡单细胞蛋白质组学的样品制备、鉴定、定量的方法，应用上述方法构建了藜麦盐囊泡单细胞蛋白质组图谱，揭示了藜麦不同发育时期盐囊泡的蛋白质组学特征，为深入开展藜麦盐囊泡单细胞蛋白质组学研究、揭示藜麦盐逆境应答机理奠定了方法学基础，并为开展其它植物单细胞组学研究提供了重要参考。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，适用于解析藜麦叶片盐囊泡不同发育时期特征的高通量单细胞蛋白组学分析，具体包括以下步骤：
3、步骤1、准备藜麦材料：将藜麦种子均匀撒在铺有湿润纱布的育苗盘中黑暗处理；第一片真叶出现后，将幼苗移栽到土壤中培养5周，挑选不同叶片用于后续试验；
4、步骤2、定义盐囊泡发育时期：在显微镜下观察、拍照，分别统计叶片近轴面和远轴面盐囊泡数量，测量盐囊泡直径；根据叶片上不同大小的盐囊泡数量和比例，定义盐囊泡发育时期；
5、步骤3、获取盐囊泡：用眉刷轻轻刷落收集叶片上的盐囊泡，计算单位质量的盐囊泡数量后分装，迅速液氮冻存；
6、步骤4、盐囊泡蛋白质提取：向装有盐囊泡的离心管内先加入溶液a，震荡、超声破碎盐囊泡细胞；加入溶液b，冰浴震荡，提取盐囊泡蛋白质；加入tris酚抽提蛋白质，加入乙酸铵-甲醇沉淀tris酚溶液中的蛋白质，并清除残留的tris酚，进而加入丙酮溶液清除残留的乙酸铵-甲醇，获得蛋白质干粉；最后，向蛋白质干粉中加入蛋白质裂解液溶解蛋白质；测定蛋白质溶液浓度，定量蛋白质；
7、步骤5、盐囊泡蛋白质酶解：首先分别利用二硫苏糖醇和碘代乙酰胺还原、烷基化蛋白质，然后利用胰蛋白酶酶解蛋白质，用三氟乙酸终止酶解反应；
8、步骤6、盐囊泡蛋白质酶解后的肽段脱盐：c18脱盐柱的活化、平衡，利用c18脱盐柱除去蛋白质酶解后肽段样品中的盐分，洗脱、冷冻干燥，收集肽段样品；
9、步骤7、盐囊泡蛋白质的鉴定与定量分析：将蛋白质肽段复溶，利用纳升超效液相色谱nanouhplc系统分离多肽，经色谱分离后的多肽，直接进入高分辨质谱仪，进行蛋白质鉴定，使用maxquant软件对高分辨质谱鉴定到的ms/ms质谱数据与藜麦蛋白质数据库进行比对和定量分析。
10、进一步地，步骤1中的所述黑暗处理时间为3天。
11、进一步地，步骤1中的第一片真叶出现时间约为7天。
12、进一步地，步骤1中的所述将幼苗移栽至土壤中，培养时间为5周，幼苗在花盆中培养条件土壤包括基质与蛭石，且为基质与蛭石的体积比为1:1混合的土壤。
13、进一步地，步骤1中的所述的培养室按照光照16h/黑暗8h的方式交替进行，控制光照温度为22℃，黑暗温度为19℃，光照强度为300μmol 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，适用于解析藜麦叶片盐囊泡不同发育时期特征的高通量单细胞蛋白组学分析，具体包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤1中黑暗处理时间为3天，第一片真叶出现时间为7天；
3.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤2中统计盐囊泡数量、测量盐囊泡直径时，分别在不同叶位近轴面和远轴面叶片的顶端、中部和基部等部位选取3个1×1mm区域，共9个区域，在体式显微镜下观察拍照；然后使用ImageJ软件统计盐囊泡的直径及数量，统计不同大小盐囊泡在各叶位中所占比例。
4.如权利要求3所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，根据不同大小盐囊泡在各叶位中所占比例，将以直径小于100μm的小盐囊泡为主的发育时期定义为盐囊泡发育I期，将以直径100～130μm中盐囊泡为主的发育时期定义为盐囊泡发育II期，将以直径大于130μm的大盐囊泡和中盐囊泡为主的发育时期定义为盐囊泡发育III期
5.如权利要求3所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤3具体包括分别用眉刷收集不同发育时期的盐囊泡至1.5mL离心管中，计算单位质量的盐囊泡数量，按照单细胞类型蛋白质组学分析的要求，将盐囊泡样品按照每管盐囊泡质量为30mg分装，迅速液氮冻存。
6.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤4中，溶液A的成分包括0.1M Tris，0.1M EDTA 2Na，0.05M四硼酸钠，0.9M蔗糖；加入溶液A的体积为160μL；在冰浴中震荡破碎，间歇超声为7分钟。
7.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤4中，在溶液A中加入溶液B，溶液B的成分包括终浓度为1％Trion X-100，1％SDS，2％NP-40，1％β-巯基乙醇，4％CHAPS，盐囊泡样品在溶液中冰浴震荡20min。
8.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤4中，在Tris酚抽提蛋白质时，加入70μL Tris-酚，pH>7.8，冰浴震荡20min，然后18 000g，4℃，离心15min；取酚层至新的1.5mL离心管；再次利用Tris酚抽提离心后剩余在管中的样品，离心后取酚相与第一次酚相合并；在沉淀Tris酚抽液中的蛋白质时，加入700μL的0.1M乙酸铵/甲醇，-20℃静置16h，然后18 000g，4℃，离心15min，弃上清液，获得蛋白质沉淀；在清洗蛋白质沉淀中的Tris酚时，加入500μL 0.1M乙酸铵/甲醇清洗沉淀，-20℃静置20min，用18 000g，4℃，离心15min，弃上清；在清洗蛋白质沉淀中残留的乙酸铵-甲醇时，加入300μL 80％丙酮，-20℃静置20min，用18 000g，4℃，离心15min，弃上清液，此过程重复2次；然后加入100μL丙酮，-20℃静置20min，用18 000g，4℃，离心15min，弃上清液，待丙酮自然挥发干净后，获得蛋白质干粉。
9.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤4中，在裂解蛋白质干粉，制备蛋白质溶液时，向干粉中加入15μL 8M尿素，冰浴超声15min，4℃振荡30min，至蛋白质干粉全部溶解。
10.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤5中，进行蛋白质还原时，在每管中加入二硫苏糖醇的终浓度为10mM，震荡混匀，37℃放置2h；进行蛋白质烷基化时，加入碘代乙酰胺的终浓度为50mM，震荡混匀，37℃避光放置45min。
11.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤5中，向蛋白质溶液中加入6倍体积的500mM三乙基碳酸氢铵，将尿素浓度降低到1.5M以下，避免影响胰蛋白酶的活性；然后，按照蛋白质与胰蛋白酶的质量比例为50:1的比例，向溶液中加入0.1μg/μL的胰蛋白酶，37℃，酶解16h；向溶液中加入终浓度为0.5％三氟乙酸，震荡混匀，终止酶解反应。
12.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤6具体包括向C18脱盐柱中加入200μL甲醇，用1000g，25℃离心至C18脱盐柱表面无液体，活化脱盐柱；然后，分三步分别向C18脱盐柱中加入40μL 80％乙腈/0.1％三氟乙酸溶液、5％...
【技术特征摘要】
1.一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，适用于解析藜麦叶片盐囊泡不同发育时期特征的高通量单细胞蛋白组学分析，具体包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤1中黑暗处理时间为3天，第一片真叶出现时间为7天；
3.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤2中统计盐囊泡数量、测量盐囊泡直径时，分别在不同叶位近轴面和远轴面叶片的顶端、中部和基部等部位选取3个1×1mm区域，共9个区域，在体式显微镜下观察拍照；然后使用imagej软件统计盐囊泡的直径及数量，统计不同大小盐囊泡在各叶位中所占比例。
4.如权利要求3所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，根据不同大小盐囊泡在各叶位中所占比例，将以直径小于100μm的小盐囊泡为主的发育时期定义为盐囊泡发育i期，将以直径100～130μm中盐囊泡为主的发育时期定义为盐囊泡发育ii期，将以直径大于130μm的大盐囊泡和中盐囊泡为主的发育时期定义为盐囊泡发育iii期。
5.如权利要求3所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤3具体包括分别用眉刷收集不同发育时期的盐囊泡至1.5ml离心管中，计算单位质量的盐囊泡数量，按照单细胞类型蛋白质组学分析的要求，将盐囊泡样品按照每管盐囊泡质量为30mg分装，迅速液氮冻存。
6.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤4中，溶液a的成分包括0.1m tris，0.1m edta 2na，0.05m四硼酸钠，0.9m蔗糖；加入溶液a的体积为160μl；在冰浴中震荡破碎，间歇超声为7分钟。
7.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤4中，在溶液a中加入溶液b，溶液b的成分包括终浓度为1％trion x-100，1％sds，2％np-40，1％β-巯基乙醇，4％chaps，盐囊泡样品在溶液中冰浴震荡20min。
8.如权利要求1所述的一种用于单细胞盐囊泡高通量蛋白质组学分析的方法，其特征在于，步骤4中，在tris酚抽提蛋白质时，加入70μl tris-酚，ph>7.8，冰浴震荡20min，然后18 000g，4℃，离心15min；取酚层至新的1.5ml离心管；再次利用tris酚抽提离心后剩余在管中的样品，离心后取酚相与第一次酚相合并；在沉淀tris酚抽液中的蛋白质时，加入700μl的0.1m乙酸铵/甲醇，-20℃静置16h，然后...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴绍军，张丽丽，王浩田，任巍巍，孙美红，张咏雪，唐莹，赵雨菲，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：
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