【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，涉及一种合成柠檬烯的菌株及其构建方法。
技术介绍
1、柠檬烯(c10h16)又名苎烯、双戊烯、1,8-萜二烯，是单萜类化合物，可以作为一些制药和商品化学品的重要前体。柠檬烯是一种植物来源的天然活性化合物，具有很高的市场价值。柠檬烯有右旋体、左旋体和外消旋体三种异构体。d-柠檬烯有类似柠檬或甜橙的悦人香味，并且已经被认定为gras(generally regarded as safe)化合物，因此作为优质香精香料被广泛应用于食品、饮料、化妆品、化学和医药工业中。l-柠檬烯则有类似松油和松脂的气味，也具有芳香添加用途。d-柠檬烯还是一种天然、绿色、环保的工业清洗剂，被广泛应用于印刷、机械、航空、电子和电器工业部件的清洗。在农业上，d-柠檬烯还用作生物杀虫剂。l-柠檬烯和d-柠檬烯还是极具潜力的新型生物燃料和生物材料。此外，以l-柠檬烯和d-柠檬烯作为前体物，可以转化合成多种具有高附加值的工业产品。最新的研究表明l-柠檬烯和d-柠檬烯都有很好的药用价值，例如d-柠檬烯具有抑菌抗菌活性，可以作为良好的天然抗菌活性物质；d-柠檬烯还具有抗癌活性、促进消化和减肥作用。
2、柠檬烯的市场需求正越来越大，但由于从植物组织中提取这些宝贵的天然产物存在着植物来源有限、目标物质含量低和分离提取难度大等缺点，因此利用微生物生产这些植物来源的天然产物就具有独特优势，也引起了越来越多研究者的关注。目前关于利用微生物代谢工程技术生产柠檬烯的研究并不多见，主要集中在大肠杆菌和酿酒酵母这两种模式菌株中，但是产量并不高，难以实现
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种合成柠檬烯的钩虫贪铜菌(cupriavidus necator)工程菌。
2、在第一方面，本专利技术提供一种合成柠檬烯的工程菌的构建方法，其是以钩虫贪铜菌h16(cupriavidus necator h16)为出发菌株，将羟甲基戊二酰辅酶a合酶基因hmgs、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmgr和甲羟戊酸激酶基因mvak整合在基因组上并替换原有的phac基因，得到h16-1菌株；将磷酸甲羟戊酸激酶基因mvak2、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因mvad以及异戊烯二磷酸异构酶基因fni整合在基因组上并替换原有的乳酸脱氢酶基因ldh，得到h16-2菌株；为了使得更多的丙酮酸流向mva途径，敲除二氢硫辛酰脱氢酶基因lpda，得到h16-3菌株；最后将包含香叶基香叶基二磷酸合酶基因crte以及柠檬烯合成酶基因ls的重组质粒转入h16-3菌株以表达这两种基因，得到h16-4菌株。
3、在一些实施方案中，上述构建方法中，所述hmgs、hmgr、mvak、mvak2、mvad和fni基因来源于黄色粘球菌(myxococcus xanthus)的mva途径。
4、在一些实施方案中，上述任一所述的构建方法中，所述hmgs基因的序列如seq idno:3中第1位至第1257位所示，其编码的羟甲基戊二酰辅酶a合酶的氨基酸序列如seq idno:4所示。
5、在一些实施方案中，上述任一所述的构建方法中，所述hmgr基因的序列如seq idno:3中第1271位至第2599位所示，其编码的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的氨基酸序列如seq id no:5所示。
6、在一些实施方案中，上述任一所述的构建方法中，所述mvak基因的序列如seq idno:3中第2613位至第3581位所示，其编码的甲羟戊酸激酶的氨基酸序列如seq id no:6所示。
7、在一些实施方案中，上述任一所述的构建方法中，所述mvak2基因的序列如seq idno:17中第1位至第1080位所示，其编码的磷酸甲羟戊酸激酶的氨基酸序列如seq id no:18所示。
8、在一些实施方案中，上述任一所述的构建方法中，所述mvad基因的序列如seq idno:17中第1094位至第2080位所示，其编码的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的氨基酸序列如seqid no:19所示。
9、在一些实施方案中，上述任一所述的构建方法中，所述fni基因的序列如seq idno:17中第2094位至第3152位所示，其编码的异戊烯二磷酸异构酶的氨基酸序列如seq idno:20所示。
10、在一些实施方案中，上述任一所述的构建方法中，所述hmgs、hmgr以及mvak基因通过自杀型质粒介导的靶基因缺失策略整合在钩虫贪铜菌h16基因组上替换phac基因，具体可以是：将hmgs-hmgr-mvak基因片段和pk19-phacdonor-xhoⅰ质粒连接得到pk19-hmgs-hmgr-mvak-phacdonor质粒，再将pk19-hmgs-hmgr-mvak-phacdonor质粒通过接合的方式转入钩虫贪铜菌h16，通过同源单交换和同源重组筛选得到将hmgs、hmgr和mvak基因整合在基因组上并替换原有的phac基因的菌株，即h16-1菌株；
11、其中，所述hmgs-hmgr-mvak基因片段如seq id no:3所示；
12、所述pk19-phacdonor-xhoⅰ质粒可以通过如下方法构建：bamhi酶切pk19mobsacb质粒，得到骨架；将phac基因的上游片段、phac基因的下游片段和骨架用gibson的方式进行连接，得到pk19-phacdonor-xhoⅰ质粒；
13、所述phac基因的上游片段是以钩虫贪铜菌h16的基因组dna为模板，用引物3(seqid no:7)和引物4(seq id no:8)进行pcr扩增得到的；
14、所述phac基因的下游片段是以钩虫贪铜菌h16的基因组dna为模板，用引物5(seqid no:9)和引物6(seq id no:10)进行pcr扩增得到的。
15、在一些实施方案中，上述任一所述的构建方法中，所述mvak2、mvad和fni基因通过自杀型质粒介导的靶基因缺失策略整合在钩虫贪铜菌h16基因组上替换ldh基因，具体可以是：将mvak2-mvad-fni基因片段和pk19-ldhdonor-xhoⅰ质粒连接得到pk19-mvak2-mvad-fni-ldhdonor质粒，再将pk19-mvak2-mvad-fni-ldhdonor质粒通过接合的方式转入h16-1，通过同源单交换和同源重组筛选得到将mvak2、mvad以及fni基因整合在基因组上并替换原有ldh基因的菌株，即h16-2菌株；
16、其中，所述mvak2-mvad-fni基因片段如seq id no:17所示；
17、所述pk19-ldhdonor-xhoⅰ质粒可以通过如下方法构建：bamhi酶切pk19mobsacb质粒，得到骨架；将ldh基因的上本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成柠檬烯的工程菌的构建方法，其是以钩虫贪铜菌H16(Cupriavidusnecator H16)为出发菌株，将羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因hmgs、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因hmgr和甲羟戊酸激酶基因mvaK整合在基因组上并替换原有的phaC基因，得到H16-1菌株；将磷酸甲羟戊酸激酶基因mvaK2、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因mvaD以及异戊烯二磷酸异构酶基因FNI整合在基因组上并替换原有的LDH基因，得到H16-2菌株；敲除二氢硫辛酰脱氢酶基因lpdA，得到H16-3菌株；最后将包含香叶基香叶基二磷酸合酶基因CrtE以及柠檬烯合成酶基因LS的重组质粒转入H16-3菌株以表达这两种基因，得到H16-4菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述hmgs、hmgr、mvaK、mvaK2、mvaD和FNI基因来源于黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述hmgs基因的序列如SEQ ID NO:3中第1位至第1257位所示，其编码的羟甲基戊二酰辅酶A合酶的氨基酸序列如
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述CrtE基因来源于深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述CrtE基因的序列如SEQ IDNO:38所示，其编码的香叶基香叶基二磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述LS基因来源于薄荷(Menthahaplocalyx Briq.)。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述LS基因的序列如SEQ ID NO:42所示，其编码的柠檬烯合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
8.由权利要求1-7任一项所述的方法构建得到的工程菌。
9.权利要求8所述的工程菌在合成柠檬烯的应用。
10.一种制备柠檬烯的方法，包括发酵权利要求8所述的工程菌合成柠檬烯的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种合成柠檬烯的工程菌的构建方法，其是以钩虫贪铜菌h16(cupriavidusnecator h16)为出发菌株，将羟甲基戊二酰辅酶a合酶基因hmgs、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmgr和甲羟戊酸激酶基因mvak整合在基因组上并替换原有的phac基因，得到h16-1菌株；将磷酸甲羟戊酸激酶基因mvak2、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因mvad以及异戊烯二磷酸异构酶基因fni整合在基因组上并替换原有的ldh基因，得到h16-2菌株；敲除二氢硫辛酰脱氢酶基因lpda，得到h16-3菌株；最后将包含香叶基香叶基二磷酸合酶基因crte以及柠檬烯合成酶基因ls的重组质粒转入h16-3菌株以表达这两种基因，得到h16-4菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述hmgs、hmgr、mvak、mvak2、mvad和fni基因来源于黄色粘球菌(myxococcus xanthus)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述hmgs基因的序列如seq id no:3中第1位至第1257位所示，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：王嘉，王竞辉，姜君鹏，岑祥许，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。